La construcción de un láser de bajo presupuesto axotomía Sistema para el Estudio de la regeneración de axones en C. elegans

Laser axotomy followed by time-lapse imaging is a sensitive way to assay the effects of mutations in C. elegans on axon regeneration. A high quality, but inexpensive, laser ablation system can be easily added to most microscopes. Time lapse imaging over 15 hours requires careful immobilization of the worm.

Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans¹. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system^2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (<$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are "close" to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (<1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers⁴). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A "Sharpie" cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.

1. Construcción de un sistema de ablación por láser

Use gafas de seguridad del láser y el uso de buenas prácticas de seguridad del láser en la alineación inicial. Nunca mire a través de los oculares cuando el láser está encendido.

1. Organizar los componentes de la placa como se muestra en la fig. 1 (véase también el ejemplo ^2). Perno por el láser (con una placa vertical, si es necesario), después de periscopio, y los apoyos tren elevado.
2. La posición de su microscopio para alinearse con el eje ferroviario. Alinearse con el haz de luz transmitido desde la lente del condensador del microscopio. Alinear la altura de la barandilla (use un nivel) y la posición con una apertura ajustable o una lente colocada en el tren. La apertura o el objetivo debe estar alineada en ambos extremos de la barra a la viga del condensador. Tomas de laboratorio pueden ayudar con el ajuste de altura de la barandilla.
3. Alinear el polarizador Glan-Thompson y media onda placa con el rayo láser. No es necesario el láser para hacer esta alineación. El bEAM sólo tiene que pasar por tanto sin golpear los bordes. Gire el Polarizador para proporcionar una orientación práctica y la posición para el volcado del haz (fig. 1). Que se gire la placa en onda media para ajustar la potencia del láser. Segura los componentes de la placa.
4. Encienda el láser, ajuste la frecuencia del pulso a 100, de modo continuo, y reducir el consumo energético al mínimo el uso de la placa de media onda. Use una nota Post-it o papel óptico para visualizar el rayo láser.
5. Ajustar y fijar los espejos montados en la secuencia cinemática del láser para que el rayo hasta el espejo que está montado en el extremo del tren elevado. El rayo láser debe estar alineada aproximadamente con el centro de los espejos. Los espejos deben estar orientadas a unos 45 grados al eje del haz láser (fig. 1).
6. Grueso ajustar el espejo cinemáticamente montado en la parte superior del periscopio y en el extremo del carril para alinear el rayo láser hacia el centro del haz de luz transmitida del microscopio. Tanto el rayo láser y ttransmitió haz de luz del microscopio se pueden visualizar de forma simultánea mediante la inserción de papel en la trayectoria del haz. Asegúrese de que los filtros ND y las aberturas en el módulo intermedio están fuera o totalmente abierta.
7. Finalmente alinear el rayo láser hacia el centro del haz de luz transmitida con los ajustes finos en la parte superior del periscopio y los espejos de ferrocarril. Mantenga el papel cerca del espejo de ferrocarril y alinear el rayo láser hacia el centro del haz de luz transmitida con el espejo del periscopio arriba. Mantenga el papel, cerca del puerto microscopio y alinear el rayo láser hacia el centro del haz de luz transmitida con los ajustes de ferrocarril espejo (fig. 2).
8. La posición de un post-it en la trayectoria del rayo entre la lente condensadora alineados y la torreta objetivo abierto. Usted debe ver el haz de luz transmitida con el rayo láser más pequeño cerca del centro. Use los ajustes finos en el espejo del ferrocarril al centro del haz de láser. Fijar el microscopio en su lugar con abrazaderas.

Los pasos 10.9-1.12 son opcionales, pero es muy fácil y útil para evaluar la alineación y la ablación con láser antes de añadir las lentes de haz en expansión.

9. Apague el láser y realizar el obturador mecánico de seguridad. Gire el dicroico de 50% de la trayectoria del haz. A pesar de que no hay luz láser directo pasará a los oculares, la luz reflejada puede ser muy intensa. Monte la diapositiva de destino para el ajuste fino y la imagen con el objetivo de aceite de 60X. Centrarse en los arañazos en la diapositiva. Puesto en el ND4 y ND8 filtro en el módulo intermedio.
10. La imagen de la meta de diapositivas con tus CLSM, disco giratorio, o el sistema de cámara CCD. Gire el dicroico 50% en la ruta de láser. Desde este punto, nunca se debe mirar a través de los oculares, mientras que la ablación con láser está encendido. Encienda el láser de ablación y establecer el modo de activado, la frecuencia a 100, y el número de pulsos a 10. Asegúrese de que el poder sigue estando ajustado al mínimo con la placa de media onda y luego abrir la válvula de seguridad mecánica. Puede simultaneouimagen socarrona y el uso de la ablación con láser.
11. Mientras que imágenes de la diapositiva de destino, activar la ablación con láser. , Comprobar el destino de un um lugar la ablación 1.10 de diámetro. Secuencialmente quitar filtros ND hasta un punto de ablación que se ve. Ajustar el punto de ablación para el centro de la imagen con el espejo de ferrocarril. Usted tendrá que volver a agregar un filtro ND para tener espacio para aumentar la potencia del láser finamente con la placa de media onda para dar a <1 um lugar de ablación. Imagen de 0,2 um / pixel o menos y ajustar con precisión el punto de ablación para el centro de la imagen (posición con 256.256 512x512 imagen).
12. Comprobar la profundidad de foco y el eje del haz de láser. Enfoque de arriba a abajo 1-2 um y compruebe la posición de ablación y el tamaño del punto de ablación. Si el haz del láser es alineado axialmente el punto de ablación no se moverá. El rayo láser no condicionado a distribuir el poder en varias um (alrededor de 3-5 um de arriba a abajo del foco).

2. Añadir lentes para ampliar el haz de láser para llenar la parte de atrás objetivoapertura y ajuste de convergencia para controlar el enfoque

1. Este sistema utiliza dos Galilea haz expansores para ampliar el haz de láser para llenar la abertura posterior del objetivo (10 mm). Monte el 4 lentes a los transportistas y las incluirá en el ferrocarril (L1f1 + L2f2 y L3f1 '+ L4f2'). Ajustar las posiciones a fin de que todas las lentes están en el mismo eje óptico y exactamente ortogonal al rayo láser (fig. 2).
2. Encienda el láser y ajustarla a la potencia mínima y el modo continuo. Más o menos ajustar la alineación del haz a través de cada lente con papel para ver el haz del láser y de transmisión del haz de luz del condensador del microscopio. Apague y disparo del láser.
3. Remueva las pinzas de un lado del microscopio y deslice el microscopio de la trayectoria del haz láser. Encienda el láser y eliminar obturador de seguridad.
4. El ajuste fino de las lentes y el rayo láser se puede realizar mediante la visualización del haz láser expandido en una pared cercana. El haz se expanden y se contraen cuando el le simétricamenteNSES se mueven. Ajustar los últimos dos espejos montados cinemáticamente para alinear el haz (fig. 3).
5. El perfil del haz alineado y expandido debe ser circular y de un brillo uniforme (fig. 3). El tamaño y la uniformidad de la viga se pueden ver con un post-it en la posición estimada de la apertura del nuevo objetivo.
6. El rayo se debe ajustar a cero la convergencia de los sistemas ópticos infinito. La convergencia se puede estimar observando cómo cambia el tamaño de la viga como se mueve un post-it más lejos de las lentes. Apague el láser y realizar el obturador mecánico.
7. Deslice el microscopio de nuevo en la trayectoria del haz láser utilizando las pinzas fijas para definir la alineación correcta. Vuelva a colocar las abrazaderas en la parte libre del microscopio, pero no apriete.
8. Encienda el láser y retirar el obturador de seguridad. Girar la torreta objetivo de una posición abierta. Coloque un post-it en el escenario. Usted debe ver el rayo láser ampliado y uniforme centrada en la b luz transmitidaEAM del condensador (fig. 4). Es posible que necesite para centrarlo aflojando las abrazaderas de microscopio y empujando con cuidado el microscopio.
9. Involucrar a la persiana de seguridad, y establecer el láser para activar el modo. Gire el objetivo de 60X en su lugar y la imagen de la superficie de arañazos en la diapositiva de destino.
10. Retire el obturador de seguridad, activar la ablación con láser y ajustar la potencia del láser para la ablación punto mínimo. El punto de ablación debe ser circular y dentro de um 5.10 del centro de la imagen.
11. Centro de la mancha de ablación con ajuste fino del espejo ferrocarril cinemáticamente montado. Usted tendrá que ajustar iterativamente los montados de ferrocarril y el espejo del periscopio arriba a llegar al centro el punto de ablación y mantener un perfil de la viga uniforme.
12. Evaluar el foco Z del láser moviendo el foco de forma sistemática y en pasos de 1 um y provocando la ablación con láser. El haz de expansión, alineados, y la convergencia debe ajustar al máximo la ablación en el enfoque de la imagen y débilmente o no un um above o por debajo de enfoque (Fig. 5).
13. Ajustar el enfoque Z de la viga ampliado moviendo la lente L3 del telescopio de Galileo (fig. 2).

3. Laser axotomía y time-lapse microscopía de regeneración axonal

1. Microondas al 10% de agarosa (RPI de Biología Molecular Grado EEO 0,1 A20090) en solución salina balanceada hasta derretido completamente. Ubicado en un plato caliente para mantenerlo fundido durante el uso para el montaje.
2. Una gota de agarosa fundida se coloca sobre un portaobjetos de vidrio y aplanado con otra lámina de vidrio en una plataforma de aproximadamente 200 um de espesor (una sola capa de cinta de tiempo en diapositivas adyacentes se utiliza como separador).
3. A "Sharpie" cap marcador se utiliza para cortar una almohadilla circular de diámetro uniforme de 13 mm.
4. Anestesia (1 ul Muscimol 20 mm) y microesferas (Chris Fang-Yen, comunicación personal) (1 ul 2,65% poliestireno 0,1 um de agua) se agrega al centro de la almohadilla seguida de 3-5 gusanos orientadas de tal forma que se acueste sobre su lado izquierdo . Un cubreobjetos se aplica y luego VaselINE se utiliza para sellar el cubreobjetos y evitar la evaporación de la muestra (fig. 6).
5. La ablación con láser se alinea con punto de mira, como se describió anteriormente, al comienzo de cada sesión. Involucrar a la persiana de seguridad láser.
6. Retire el objetivo de alineación láser y la imagen de un gusano adulto montado con un marcador adecuado fluorescentes en las neuronas. Axones de imagen con un aumento similar (0,2 um / pixel o mayor aumento) y la posición en el punto de mira (fig. 7).
7. Abrir el obturador de seguridad láser y activar la ablación por láser, mientras que la imagen. Evaluar el axón después de la activación del láser y poco a poco aumentar la potencia del láser hasta que el axón se corta. Se necesitan unos 10 veces más energía láser para cortar los axones más que para formar un punto de ablación en la diapositiva de destino de alineación (sobre 1UJ / ns pulso). Por lo general corta con 100 pulsos de 2,5 kHz y alimentación en la posición de 0.27mW (energía promedio medido en muestras con un medidor de energía coherente FieldMaxII láser y ajustado en continuo a 2500 Hz). La ablaciónestablecimiento de la potencia del láser será consistente para el corte de los axones en futuros experimentos (fig. 7).
8. Un axón con éxito corte mostrará un descanso de alrededor de 0,5-1 um sin pérdida de brillo en los dos extremos cortados (fig. 7). Una gran pérdida de brillo o una gran brecha (2-10 um) a menudo significa daños más allá del axón de una burbuja de cavitación. Los axones proximales y distales se separan y forman bulbos de retracción en los próximos 30 minutos (fig. 8 y película).
9. Equilibre sus gusanos montado con su platina del microscopio durante 30 minutos antes de comenzar la grabación lapso de tiempo. Esto reducirá al mínimo la deriva debido a las diferencias de temperatura y la contracción de agarosa.
10. ) Lapso de tiempo los parámetros de imagen se configuran mediante el software de imágenes asociadas con el sistema. Por lo general la imagen pasos 10-20 Z (1um/step) a 0,1-0,2 um / pixel con la ganancia, diafragma, velocidad de exploración, y la imagen la configuración de energía láser que minimizar la exposición al tiempo que la resolución espacial deseada. Intervalos de muestreo son típicosly 1-5 minutos más de 15 horas, dependiendo de la resolución deseada temporal (fig. 8 y película).
11. Lapso de tiempo los datos de imagen se convierten en películas usando los elementos de NIS o ImageJ.

4. Los resultados representativos:

Laser axotomía uso de este sistema es un fiable y de rutina. Los resultados se muestran en la figura 7 son típicos. Time-lapse de imágenes de la regeneración axonal es muy robusta, con este protocolo. En forma rutinaria corte y de imagen de hasta 5 axones en 5 gusanos diferentes en una sola diapositiva con una platina motorizada. La única limitación es el tiempo que se tarda en recoger las imágenes de cada axón, por ejemplo, si se tarda 20 segundos para recoger una pila de un axón, entonces la mayoría en el podrá degustar nueve axones (9 pilas) si se toma de muestras cada 180 segundos. El ejemplo que se muestra en las figuras 8 y 9 es el resultado buen representante. Aproximadamente el 10% de los experimentos dan resultados de esta calidad. El resto de experimentos proporcionan datos fiables sobre el fenotipo de la regeneración, pero son estéticamente unappealción, debido a pequeños movimientos de trepidación de la lombriz, que generalmente comienza después de 5-8 horas de inmovilización.

Figura 1 sistema de ablación por láser. La onda de 532 nm Nd: Yag láser está montado sobre una placa vertical para llevarlo a la altura de los otros componentes y atornillados a la placa. (Aislador óptico es opcional y, probablemente, no es necesario). El polarizador Glan-Thompson y la placa de media onda se utilizan para controlar con precisión la potencia del láser. Se monta en la rotación finamente calibrado. Tenga cuidado de establecer el volcado de la viga. El espejo esquina dirige el rayo láser hacia el espejo del periscopio inferior. El espejo del periscopio superior dirige el haz hacia el espejo de ferrocarril. El riel está montado sobre dos plataformas de la barra apoyada. Doble lentes de Galileo se unen a los montajes riel de deslizamiento. Observe el módulo añadido intermedio dedicado a la ablación con láser. El sistema podría ser más compacto mediante la eliminación de la óptica de aislamientotor y el espejo de la esquina, y la recolocación del láser, polarizador Glan-Thompson y la placa de media onda en el borde trasero de la placa.

Figura 2 lentes de doble acondicionado Galileo se utilizan para ampliar la UM 300 TEMoo rayo láser a un tamaño uniforme de convergencia a cero de 10 mm. Un gato de laboratorio se coloca en una de las plataformas de la celebración de la barandilla. Esto ayuda a ajustar la altura de la barandilla durante los pasos de la alineación. Crudamente ajustar la altura de la barandilla de montaje de la lente L1 a la barra y con el haz de condensador como una guía de alineación. Ajuste el riel para que el haz del condensador se alinea con el centro de la lente en ambos extremos de la barra. Esto asegurará que el ferrocarril está alineado en paralelo al eje óptico del microscopio. Puede que tenga que ajustar primero el microscopio para que coincida con el eje óptico del tren. Utilice abrazaderas para fijar la posición del microscopio (ver fig. 1). Quitar ªe sobre carriles de la lente. Ahora alinear el rayo láser hacia el centro de la viga del condensador en ambos extremos de la barra. Un artículo publicado en la trayectoria del haz es una manera conveniente de ver los dos haces de forma simultánea. Use el espejo del periscopio arriba para alinear el rayo láser a la viga del condensador cerca del espejo sobre raíles. Utilice la barra montadas en los espejos para alinear el rayo láser a la viga del condensador en el otro extremo de la barra (la más cercana al microscopio). Ahora montar las cuatro lentes para el ferrocarril, como se muestra en la figura. La longitud del carril, la distancia focal de las lentes y los acuerdos de la lente pueden variar en función de su microscopio y conjunto físico para arriba. Los parámetros críticos son el diámetro del rayo láser y el tamaño de la abertura posterior del objetivo elegido. Infinidad de sistemas ópticos se centrará un rayo láser perfectamente paralelos (cero de convergencia). Distancia entre L1 y L2 deben ser la suma de las lentes de distancia focal, f1 + f2, y la distancia entre L3 y L4 en consecuencia debe ser f1-f2 + '. La distancia entre los díaspares e doble de Galilea no es crítica. Posición de la L3 puede ajustarse con precisión para controlar la convergencia del haz; <1 mm ajustes serán necesarios para ajustar el enfoque del láser para el enfoque de la imagen. Asegúrese de eliminar todas las lentes, filtros, aperturas, etc desde el módulo intermedio que podría estar en la trayectoria del haz (o estar al tanto de lo que hacen y ajustar el sistema en función).

Figura 3 Alineación del haz de láser a través de los lentes de Galileo dual. Retire las abrazaderas microscopio de un lado del microscopio por lo que el microscopio se pueden mover fuera del camino del haz, pero el resto de las abrazaderas permitirá al microscopio para determinar con precisión de posición. Piense en la seguridad del láser. Asegúrese de que la potencia del láser se ajusta al mínimo con el polarizador de Glan-Thompson. Encienda el láser y ver el patrón de rayo láser en la pared. Usted puede encontrar un papel pegado en la pared para ver la ayuda del láserspot. Sistemáticamente ajustar las posiciones de las lentes para tener una idea de lo que hacen con el tamaño del haz y la apariencia. Usted debe ver algo que se parece el panel A, en un lugar es intensa excéntricamente en un perfil de dimmer. Use el espejo sobre raíles para ajustar el punto intenso en el centro como se muestra en el panel B. Ahora usa el periscopio arriba montadas en los espejos para dar un perfil periférica uniforme. Si todo se alinea correctamente, ahora debe encontrar que el traslado de las lentes hace que el haz de expandirse y contraerse simétricamente. Mover las lentes de nuevo a las posiciones de partida, como se muestra en la figura 2. Ahora interceptar el rayo a la distancia de la abertura posterior objetivo. Debe circular, por lo menos lo suficientemente grande como para llenar su apertura hacia atrás, y de un brillo uniforme. Está bien si es más grande, siempre y cuando usted tiene la potencia del láser suficiente para su ablación. Evaluar la convergencia mediante la comparación de diámetro del haz a la distancia de la abertura de nuevo el objetivo y la pared. Haz de diámetro debeser el mismo para un haz de convergencia a cero. Barra de escala es de 10 mm.

Figura 4 Alineación del haz de láser ampliado a la viga del condensador. Del obturador y mover el láser del microscopio de nuevo en la trayectoria del haz de láser utilizando las pinzas como paradas de la alineación. Encienda, alinear y enfocar el haz del condensador, utilizando un objetivo de la lente. Cinta de papel sobre los oculares para evitar que cualquiera pueda ver la intensa luz reflejada del láser. Girar la torreta objetivo de una posición abierta. Ponga un pedazo de papel en el escenario para ocluir el haz de condensador. Gire el láser sobre el modo continuo y eliminar el obturador mecánico de seguridad. Usted debe ver algo de luz láser que viene, aunque el microscopio. Afloje las abrazaderas de microscopio y suavemente empujar el microscopio para alinear el rayo láser con el haz de condensador. El haz de láser debe ser circular y de un brillo uniforme. A veces es útil para adyust el carril montado en lentes. Usted debe ser capaz de expandirse y contraerse el rayo láser de manera uniforme si la alineación es correcta. Puede centrar el haz de láser contratado para el haz de condensador centrada mínimo con el espejo sobre raíles y luego ampliarlo al tamaño deseado. Una vez que ajuste la posición del haz de un contrato con el espejo de ferrocarril, tendrá que volver a ajustar la parte superior espejo montado periscopio para mantener un brillo uniforme del haz expandido. Si usted no puede obtener un haz de láser centrado circular entonces usted tendrá que volver a pasar por los pasos de la alineación anterior.

Figura 5 Centro el punto de ablación y ajustar la convergencia rayo láser para el enfoque óptimo. Apague y disparo del láser. Retire el papel y el montaje de la diapositiva de destino espejo (también se puede utilizar tinta de rotulador permanente en un cubreobjetos como objetivo ^2). Rasguños en la superficie de la imagen reflejada con el 60X lente de aceite 1.4na) Ahora la imagen de la superficie con un confocal o CCD. No mire a través de los oculares, mientras que el láser está encendido. Encienda y unshutter el láser. Ajuste el láser para activar el modo, la potencia más baja, y 100 Hz.. Disparador de 10 pulsos. Usted debe ver un punto de ablación de 1-5 um de diámetro de 10 um del centro de la vista. Si usted no ve un punto de ablación puede aumentar la potencia del láser en los pasos del 5-10%. Una vez que identifique un punto de ablación, el centro para el campo de visión. Poner la cruz en 256, 256 coordenadas si la visualización de imágenes de 512x512. Si ajusta el punto láser en el centro, entonces no va a cambiar de posición con el zoom. Utilice la barra montadas en los espejos para mover el punto de ablación para el punto de mira central. Reevaluar la uniformidad del haz de láser mirando la viga con el objetivo de eliminar como se describió anteriormente en la Figura 4. Ajustar la uniformidad de la viga con el espejo del periscopio montado en la parte superior. Repetir la evaluación de la posición al contado de ablación. Este es un proceso iterativo proceso que se debe repetir hasta que el punto se centra la ablación y el haz de expansión es uniforme. Si se hace correctamente el punto de ablación será circular como se ve en el acto de ablación en foco en la figura. Siguiente evaluar el enfoque del rayo láser en el eje Z. Activar el láser para producir un punto de ablación de alrededor de 1 um en el centro. Ahora mueve la diapositiva alrededor de 5 um lateralmente y se centran 1 um por debajo de la superficie de la diapositiva de destino. Activar el láser con la configuración de láser que se utiliza para el acto de ablación en primer lugar. Repita después de enfocar un um por encima de la superficie de la diapositiva de destino. Si el rayo láser se centra en el enfoque de la imagen, entonces debería ver un patrón similar al mostrado en esta figura. El punto más grande de la ablación debe corresponder al enfoque de la imagen y los puntos de ablación por encima y por debajo de atención deben recibir más pequeñas simétricamente. Ajustar la lente L3 para alinear los planos focales. Mover la lente L3 lejos del microscopio hará que el haz de luz más convergente y el lugar de ablación se acercará ael objetivo. Pequeñas <1 mm ajustes serán necesarios cerca de foco. Ahora está listo para cortar los axones. Barra de escala es de 1 um.

Figura 6 gusanos de montaje para axotomía láser y time-lapse. Agarosa al 10% en solución salina se calienta hasta derretido completamente. Una pequeña gota se coloca en un portaobjetos de vidrio y luego aplanado con otra diapositiva para formar un pedazo de chapa plana. El grosor de la almohadilla se fija con cinta adhesiva en dos diapositivas adyacentes. El pad está autorizado a fijar por cerca de 1 minuto y luego las diapositivas se separan. A "Sharpie" de arriba se utiliza como molde para formar una plataforma de tamaño uniforme, de unos 13 mm. 1 ul de 10 mM muscimol y 1 ul de microesferas se añaden al centro de la almohadilla (Fang-Yen comunicación personal). Los gusanos se agregan a la caída de 2 ul y orientados antes de colocar el cubreobjetos. Vaselina se aplica con una jeringa (20-25 ga. Aguja) hasta el borde del cubreobjetos para sellarlo.

Figura 8. Típico tipo salvaje L4 regeneración. Esta es una serie temporal que muestra la ablación y de lapso de tiempo de grabación de la regeneración de los axones. Poco después de axotomía láser a los 0 minutos se puede ver la bombilla de la retracción. Por 138 minutos, la lámpara de retracción se retiró de nuevo a su extensión más larga y comenzado a remodelar. Protuberancias esporádicos de membrana (mircospikes o filopodios) se puede ver a lo largo del eje del axón (flechas 138 y 324). Lamuñón derecho se extiende un cono bien formado crecimiento compacto a los 360 minutos. En 414 minutos los dos tocones se han extendido los conos de crecimiento. La inicial de tipo embrionario conos de crecimiento se distrófica, ya que se extienden hacia el cordón nervioso dorsal (414, 519 y 597 minutos). Los conos de crecimiento distrófico puesto por debajo del cordón nervioso dorsal (960 minutos). Puntas de flecha señalan muñón proximal y los conos de crecimiento. Las flechas señalan las protuberancias de membrana a lo largo del eje del axón proximal. 20um barra de escala.

Movie 1. Película de la regeneración axonal tipo salvaje. Esta película va de la mano con los puntos de tiempo se muestra en la Figura 8. Los gusanos fueron montadas como se describe en el protocolo y los axones fueron estudiados cada tres minutos durante 10 horas. Z pilas (20 X 1um) fueron tomadas en cada momento y se fusionó en una sola imagen por un algoritmo de proyección máxima (Elementos NIS). Haga clic aquí para ver la película.

There are several good discussions of laser microsurgery with different laser systems^3,5-11. Femtosecond IR lasers are the "gold standard" for subcellular laser ablation¹² and convenient if associated with an imaging facility, but they are often too costly for individual users. If you require a femtosecond IR laser for imaging your sample because of depth of imaging then you will probably need one for laser axotomy. Transparent tissues with target axons within 30-50 um of the surface are probably feasible with blue and green pulse lasers in the 20 uJ/pulse range targeted through a high na immersion lens. There will be more collateral damage with the nano and pico second lasers compared with the femtosecond laser, especially as the depth of the target axon increases. C. elegans is transparent and all axons are within 20-30 um of the surface. We routinely cut motor axons that are within 5 um of the surface. We have also easily cut axons within the nerve ring that are about 20 um from the cuticle surface. We found the limit for cutting axons to be about 30-50 um through the diameter of an adult worm. It is likely that the laser ablation system described here would work well with many different preparations that fit the criteria of transparency and depth of target axons. Still, it is a bit surprising, given the theoretical advantages of the femtosecond IR lasers, that nano and picosecond 355 nm and 532 nm lasers perform so well for laser axotomy in C. elegans^6,13. We see no differences in axon regeneration in response to laser axotomy with nanosecond 440 nm, nanosecond 532 nm, and femtosecond IR lasers.

Solid state 355 nm UV lasers are about the same cost as the 532 nm diode pumped passively Q-Switched solid state laser, but require either higher powers or optics that efficiently pass these shorter wavelengths. Most optics are designed to perform well with visible 400-700 nm light. 355 nm lasers would offer some advantages⁶ such as reduced plasma threshold, smaller spot size, and a long pass dichroic would efficiently direct 100% of the ablation laser to the target and allow simultaneous imaging of GFP without loss of sample signal. Blue 440 nm lasers would retain the advantages of working with a visible light laser (good performance with standard optics and safety). Unfortunately, the cost of a DPP Q-switched solid state 440 nm laser is 3 times the cost of a 355nm or 532 nm laser of similar power at this time. If we were designing a new system for C. elegans , where target depth is minimal, we would opt for a UV transparent lens (cost about $3,000 for a 40X 1.3na oil lens with 50-70% transmittance at 355nm) and a 355 nm laser producing 5-10 uJ/pulse at 1-20 kHz.

Axon ablation is thought to be due to plasma formation. Shorter pulses will produce plasma thresholds at lower power and the plasma volumes will be smaller⁶. The goal is to produce the smallest and shortest-lived plasma by adjusting the pulse energy to the lowest power. Larger long-lived plasmas will generate cavitation bubbles that damage surrounding cells. We have generally found that ablation using about 50-100 pulses at the highest frequency (i.e. 2.5kHz) gives the best results. This suggests that damage can be gradually integrated over a series of pulses to better control the extent of damage. The laser ablation system described here is very forgiving if the beam is aligned and expanded accurately. We start cutting axons in adult worms at 10% laser power (average of 0.3 mW measured at 2500 Hz and estimated 1 uJ/pulse) and can cut with limited localized damage through 14% power. You can observe larger areas of damage from 15-39% laser power, but only above 40% power (about 1 mW average measured at 2500 Hz) do the worms explode due to large cavitation bubbles and damage to the worm's cuticle.

The Steinmeyer et al. 2010² paper is an excellent resource for constructing a laser ablation system. Leon Avery also has a nice practical description of a laser ablation system based on an inexpensive N2 gas 337 nm laser and he provides some great practical advice (elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/). When designing your own system you should first talk with your microscope representative to determine how to target the ablation laser to the microscope objective. Your microscope should be mounted on a vibration isolation table (Newport, TMI, Thor). A breadboard top is optimal, but a solid steel top can still be used with magnetic positioners. A dedicated intermediate module on an upright scope is nice because all optical elements can be left in place. However, it may be less expensive and more convenient to use a camera port (inverted) or a "combiner" attached to an epi-fluorescent port. You need to know the size of the back aperture and the transmittance (at the ablation laser wavelength) of the objective lens you intend to use. Once you decide on a laser (e.g., Crylas, TEEM, Crystal, or CRC) you should contact Thor or Newport for help with selecting the correct optical elements, hardware and safety equipment. We decided on a dual Galilean beam expander to save space, but a simpler Keplerian expander is an option (f2/f1=expansion factor). A custom beam expander will be the least expensive, but Newport, Thor, and several of the laser manufacturers offer excellent quality commercial beam expanders. Some laser manufacturers also offer manual and electronically controlled attenuators that may be cost effective and space saving, but not as versatile as the Glan-Thompson polarizer and half wave plate. You will also need to decide how to control the laser. You can design a LabView based controller, use a commercial TTL generator, or software provided by the laser company. Discuss the options with the specific laser manufacturer.

We have provided a list of the hardware we have used only as a general guide. The system described here cost about $15,000 when added to our existing imaging system. Your local Physics department will often have someone willing to provide a practical introduction to safely working with free beam lasers.

Alternative methods for immobilization and time lapse imaging of C. elegans have been recently described.¹⁴

Troubleshooting

The most difficult and critical step is alignment of the centered expanded beam to the optical axis of the microscope. Once you have the beam centered and expanded through the Galilean lenses you should work hard to get it aligned to within 5 um of the microscope's optical axis BEFORE using the steering mirrors for the final alignment to the center. Excessive use of the steering mirrors to align the beam to the microscope will move it off axis through the beam expander. USING EXTREME CAUTION you can attenuate the laser beam with the appropriate ND filter and directly view the laser beam profile on a reflective target (front surface mirror). You can gently nudge the microscope to precisely center the beam in the 60X objective field of view (if it can't be centered in the up/down range you need to adjust the rail height). The beam profile can be used to precisely align the microscope optical axis to give a centered beam that is circular and "flares" symmetrically. An asymmetric flare is an indication that the microscope axis is not perfectly aligned (or the rail is not level). Finally, you should adjust L3 and see an even and symmetrical expansion and contraction of the beam. Focus the microscope precisely on the target surface and then adjust L3 to focus the laser beam to the smallest spot. You should now find that the laser beam is within 5 um of the center when imaged via LSCM or CCD system and the ablation spot is within 1um of Z focus.

If you find you are "blowing up" worms or consistently generating large cavitation bubbles to cut axons your problem is most likely the fine alignment of the ablation laser. Make sure the minimum (<500nm) ablation spot is localized to the Z focus (adjust convergence with L3 lens) and to the XY fiduciary spot (adjust with last kinematically mounted mirror).

Targeting axons closer to the surface will require less laser power. Similarly, smaller animals (L1 and L2) will require less laser power for axotomy compared to targeting the same axons in adults.

If your wild type axons do not regenerate or the axons bleach you should try reducing imaging laser power or decreasing the sampling rate. If your worms die or become sickly try reducing the percent Agarose in 1% steps. Make sure you are not moving the coverslip after mounting worms as this will often cause them to die when using high percentage agarose and microspheres.

If your worms burst or die during a time-lapse session it is due to: 1. Percentage agarose is too high. 2. Damage to cuticle by ablation laser. 3. Movement of coverslip after mounting. If damage to the cuticle is at fault it will only affect mounted worms that have been targeted with the ablation laser.

If your worm moves too much during a time-lapse session try increasing the percentage agarose in 0.5% steps. Healthy axons in healthy worms are always "active" and display a consistent level of fluorescence. If you see a sudden decrease in fluorescence or activity the worm is dying or dead. Multiple beaded or fragmented axons are a sure sign of a dying or dead worm.

If you have trouble keeping your axons in focus during the entire time lapse session there may be several different problems. First check your stage drift by imaging an inert sample on a glass slide over 10 hrs. A few microns drift may be due to thermal instability, but greater than 5 um is probably due to mechanical issues with your microscope. Problems with mounting are more common. Let your mounted worms equilibrate with your microscope stage for 30 minutes before starting your time lapse. Check that your Vaseline seal did not develop leaks during the course of your time lapse session.

No conflicts of interest declared.

This research was supported by the National Science Foundation, the McKnight Endowment Fund for Neuroscience, the Christopher and Dana Reeve Foundation and Amerisure Charitable Foundation.