Visualizar el corazón latiendo en Drosophila

Técnica necesaria para la visualización de los latidos del corazón en adultos y larvas Drosophila Se presentan. Cada etapa de la vida requiere de una metodología diferente.

La

Antes de empezar

Corazones adultos

1. Recién preparar hemolinfa artificial (IA) solución que contiene 108 mm de Na ^+, 5 mM K +, 2 mM Ca ^{2 +,} 8 mm _de MgCl2, 1 mM NaH ₂ PO _4, 4 mm _de NaHCO3, sacarosa 10 mM, trehalosa 5 mM, HEPES 5 mM (pH 7.1, todos los reactivos de Sigma Chemicals). La sacarosa y la trehalosa, debe añadirse a la AH de las soluciones madre refrigerados antes de su uso con el fin de prevenir la contaminación bacteriana.
2. Traiga AH a temperatura ambiente y oxigenar la solución por vía aérea-burbujas durante al menos 15 min.
3. Tire de varios capilares finos (por ejemplo, capilares de vidrio, 100 ul, VWR) necesarios para la eliminación de grasa.

Corazones larvas

1. Sylgard recubierto cubreobjetos: con un palillo de dientes, la transferencia de unos 50-70μl de solución Sylgard en un cubreobjetos 22x22mm. Deje que el endurecimiento Sylgard a 65 ° C durante la noche.
2. Preparar el Broadie y tampón de Bate (135 NaCl, KCl 5 mM, 4 mM MgCl _2, 2 mM CaCl _2, TES 5mM, sacarosa 36 mm;. PH 7,15 Ver Broadie y Bate, 1993).
3. Prepare las herramientas necesarias para aplicar el pegamento histoacryl. En primer lugar, tirar de varios capilares finos (por ejemplo, la Ciencia Productos GB100T8P). Conecte una punta de la pipeta 1,5 ml con un tubo de plástico delgado (Tygon, 1 / 32 ") mediante la inserción de la pequeña en el tubo. Insertar un tubo capilar con su amplia apertura hacia el otro extremo. De carga del capilar con pegamento Histoacryl por inmersión de la capilaridad en una gota de pegamento y una succión suave en la punta de plástico. Cuando se trabaja con el pegamento que uno debe tener un vaso capilar segunda mano para quitar exceso de pegamento en la punta de la cola capilar. La cola es un líquido hasta que se entra en contacto con solución salina amortiguada donde se endurecerá en un par de segundos. Sin embargo, por lo general sigue siendo de plástico el tiempo suficiente para ser removido de la punta de la cola capilar o si bien se aplica a la muestra.

Semi-intacta Drosophila corazón de la mosca adulta

1. Las moscas adultas de Drosophila se anestesian con siesta Fly (Carolina Biological Supply Co.) por 2-5 minutos. Se debe tener cuidado de no dejar que las moscas de la siesta para volar largas exposiciones. La exposición a corto plazo al frío también puede ser utilizado para anestesiar a las moscas de CO _2, pero no es recomendable ya que tiene más efectos duraderos sobre la frecuencia cardiaca y rítmica.
2. Moscas anestesiadas se colocan, cara dorsal hacia abajo, en una placa de Petri revestida con una capa fina de vaselina. La cutícula hidrófoba en las alas y el cuerpo de forma reversible "pegarse" a la gelatina, pero la marcha se puede colocar si es necesario. Esto es especialmente importante durante las manipulaciones posteriores.
3. Una reducción inicial se realiza mediante un par de tijeras curvas de primavera (Roboz # 5611). Las cuchillas de tijera se colocan debajo de las piernas en ángulo hacia abajo y hacia la superficie dorsal del tórax cerca del cuello. La cabeza, el cordón nervioso ventral, las piernas se retiran con un solo corte. La preparación se sumerge en un hemolinfa oxigenada, artificial (IA) solución.
4. Con la tijera de primavera el extremo posterior del abdomen (compuesto de segmentos abdominales 7 y 8) se elimina con un solo corte. Esto proporciona un acceso lateral para realizar cortes a lo largo de ambos bordes del abdomen y sirve para cortar la conexión entre el intestino posterior y la cutícula abdominal. El colgajo libre de la cutícula ventral de abdomen, luego se retira.
5. En los pasos 3 y 4 de las conexiones anteriores y posteriores de la tripa se cortan para los órganos abdominales se encuentran ahora en su lugar gracias tracheols. El intestino y otros órganos abdominales se pueden quitar generalmente como una masa única con las pinzas de joyería (Roboz, # 55) y suave tirón. La eliminación de los órganos internos revela el tubo de corazón que late todavía en la cutícula dorsal rodeada de cuerpos grasos.
6. Los cuerpos de grasa son muy opaco en el microscopio de luz en consecuencia a menudo es necesario para eliminar parte de esta grasa con el fin de ver el tubo de corazón claramente. Esto se logra mediante una técnica de liposucción utilizando capilares de vidrio finamente elaborado. Los capilares se hacen usando una pipeta estándar extractor (Por ejemplo, Sutter P-97 con una pipeta asistente de cámara) y se inserta en un tubo de plástico (Tygon, 1 / 16 ") conectado a una fuente de vacío. Este sistema se utiliza para succionar el exceso de grasa alrededor del tubo cardíaco. Fuerza de succión es proporcional al diámetro de la punta para pipetas con puntas superiores a 40 micras de diámetro, no debe ser utilizado. El cuidado extremo se debe tomar para evitar el contacto con el propio corazón y por la parte posterior del corazón es muy frágil que la región debe evitarse por completo.
7. El adulto tubo de Drosophila corazón quedará al descubierto y deben ser golpes. Si es necesario el corazón cutícula y adjunto se puede colocar con cuidado, levantando la cutícula de la vaselina y cuidadosamente apisonado de vuelta, de nuevo evitando cualquier contacto con el tejido del corazón. En tsu punto de vista la solución del baño de la preparación debe ser reemplazado por AHL fresco. Esta preparación se debe permitir que se equilibre durante 20-30 minutos con la oxigenación antes de cualquier manipulación. Si la preparación se ha de mantener durante más de 60 minutos que deben ser preservados con AHL fresco.

Inmovilización de las larvas de Drosophila para la grabación óptica

1. Coloque una gota de pegamento Histoacryl cerca de cada esquina del cubreobjetos Sylgard. Añadir 50μl de tampón B & B a las gotas de pegamento que se endurece al instante. Llenar el espacio entre los puntos de pegado con B & B - el pegamento se mantenga la memoria intermedia en la diapositiva.
2. Tome un vagabundo larva L3 y colocarlo en un pañuelo de papel mojado en hielo durante 2 min. Esto retrasará su movimiento. A continuación, traslado a la larva en el búfer y orientarlo con el dorso hacia arriba (este es el lado de la larva que carece de los cinturones de dentículo). Aplicar rápidamente un poco de pegamento entre la región de la cabeza y el Sylgard. El pegamento se endurece muy rápidamente y evitar que la cabeza de la larva que se mueva.
3. El uso de pinzas con cuidado agarra al animal por los espiráculos posteriores y suavemente estirar. Fijar la larva en esta posición mediante la aplicación de la cola a ambos lados de la larva en la mitad posterior. Para reducir aún más el movimiento de la cutícula de los músculos de la pared del cuerpo, agregue más pegamento en los flancos del animal. La larva se ha fijado ahora en esta posición. El cubreobjetos se puede colocar en una pequeña placa de Petri llena de AHL o PBS. Latidos del corazón ahora se puede grabar sin la interferencia de los movimientos de la pared del cuerpo.

Los resultados representativos:

El semi-intacta corazón adulto de Drosophila se latir rítmicamente durante horas después de la disección cuando se mantiene en el AH fresca y oxigenada (ver datos suplementarios, Ocorr, et al., 2007). Un ejemplo representativo se muestra en la película 1. Corazones desde el ³ de instar de la larva y las moscas jóvenes (1 - 3 semanas después de la eclosión) generalmente presentan un ritmo regular del corazón a un ritmo de entre 1 - 3 Hz. Las moscas más de tres semanas por lo general son más arrítmico, sin embargo, estos corazones son todavía capaces de vencer de forma espontánea durante horas en AHL oxigenada. Corazones en moscas adultas que se encuentren dañados como consecuencia del procedimiento de disección suelen mostrar regiones localizadas de la constricción extrema que no pueden relajarse. Las tasas de latidos del corazón más lento que 1 Hz se observan rara vez en las moscas de menores de 3 semanas de edad y, en consecuencia de estas preparaciones se consideran dañados y se descartan.

Haga clic aquí para descargar la película 1. - A una semana de vida volar tipo salvaje adulto (cepa de laboratorio w ¹¹¹⁸⁾ que muestra el tubo expuesto corazón abdominal (anterior a la izquierda). Tenga en cuenta las contracciones regulares y rítmicos. Zonas opacas en la esquina superior derecha están los restantes órganos de la grasa abdominal, células redondas a cada lado del corazón son las células del pericardio.

El modelo de Drosophila ha demostrado ser una potente herramienta genética que se ha utilizado para tratar una variedad de problemas científicos que van desde el desarrollo embrionario para el aprendizaje y la memoria. Recientemente, este organismo modelo versátil se ha utilizado para investigar la genética de la función cardíaca en la marcha. Un número de intentos de cuantificar la fisiología del corazón en adultos de Drosophila se han basado en observaciones realizadas en las moscas intacta a través de la cutícula abdominal. La mayoría de estos enfoques se han basado en la observación visual o grabaciones de los cambios en el transmisor de intensidad de la luz a través del abdomen de cuantificar un solo parámetro, la frecuencia cardíaca. Estos métodos tienen varias limitaciones: por lo general sólo el extremo anterior del corazón se puede observar, lo que se observa es el movimiento de los cuerpos de grasa secundaria a las contracciones del corazón, y la entrada nervioso hasta el corazón está intacto. El adulto semi-intacta la preparación proporciona una visión más detallada de una gran parte de la cuantificación del corazón que permite el funcionamiento de una serie de parámetros, además de la frecuencia cardíaca. Puede ser utilizado para electrofisiológicos u ópticos (ver artículo JOVE, 1435) los procedimientos de registro. Además, esta preparación es adecuada para la manipulación histológico (ver artículo JOVE, 1435). También se puede extraer como una muestra de tejido cardiaco relativamente limpia de PCR, Western blot, análisis de microarrays, etc

El corazón de un adulto en Drosophila es, a los efectos de esta disección, convenientemente fijado a la cutícula dorsal del abdomen por una red de músculos Alary. Por lo tanto, es posible diseccionar la cabeza y la médula ventral del nervio mintiendo, y luego para extraer los órganos internos sin dañar el corazón. Sin embargo, el cuidado extremo se debe tomar en el paso 3 para cortar sólo la punta del abdomen, el corazón se extiende en el segmento abdominal 5 / 6 y una célula o células marcapasos está sin duda presente en esta región.

También se debe tomar para evitar tocar el corazón durante la disección. Si el contacto con el corazón se sospecha que la preparación debe ser desechada. Succión moderada suele ser suficiente para quitar algo de la grasa y tracheols que rodean el corazón para una mejor visualización del tubo de aspiración del corazón, pero excesivo también puede dañar el corazón. La fuerza de succión es controlado principalmente por el tamaño de la punta de la pipeta utilizada para la liposucción, las puntas de más de aproximadamente 40 micras deben ser evitados.

A diferencia de los adultos, el tubo cardíaco en larvas de Drosophila es relativamente libre de moverse alrededor de la cavidad del cuerpo. Por lo tanto una preparación semi-intacta corazón larval presenta dificultades para las técnicas de grabación óptica. Debido a la transparencia de los tegumentos es posible visualizar el corazón en la larva intacta mediante microscopía de campo claro. La técnica descrita aquí pegamento inmoviliza larva de cualquier etapa de desarrollo y mantiene el corazón en una posición fija. Esto permite la grabación de un tubo de corazón relativamente estacionario. Las contracciones del corazón registrados por larva como inmovilizado puede ser analizada por la técnica de grabación óptica se describe en JoVe 1435.

KO con el apoyo de una beca de la Asociación Americana del Corazón.