La disección de Saccharomyces cerevisiae Asci

Micromanipulación de células de levadura que se necesita para el análisis genético meiótica o para seleccionar cigotos diploides. Estos micromanipulaciones se llevan a cabo con la microaguja de un microscopio de disección. La microaguja se utiliza para trasladar las células y es controlado por un micromanipulador que están disponibles con diferentes grados de automatización.

La levadura es un sistema modelo muy manejable que se utiliza para estudiar muchos procesos celulares diferentes. La cepa de laboratorio común

Construcción de cepas diploides
Protocolo para la producción de diploides en el apareamiento

1. Las cepas inicial debe ser ponchado en medio YPD, o selectiva, si es necesario, para producir colonias aisladas. Las dos cepas haploides debe ser de tipo de apareamiento opuesto (es decir, Mata y MATα).
2. El uso de un asa de siembra estéril recoger una pequeña parte de una colonia de una de las dos cepas haploides. En una racha de nueva placa YPD el circuito una vez en una línea recta a través de la placa. Marca la dirección de la veta con una flecha en la parte inferior de la placa.
3. Repita esta operación para la segunda cepa de la placa de YPD mismo. Esta vez la racha perpendicular a la primera colonia, cruzar la primera racha con el segundo. Marca la dirección de la segunda racha y tenga en cuenta la zona en la segunda racha cruza el primero. Esta área será donde se producirán los diploides.
4. Incubar la placa de YPD a 30 ° C durante la noche.
5. Replica la placa de la placa de YPD en medios selectivos que permiten selectivamente el crecimiento de los diploides recién formado.
6. Elija una sola colonia, si es posible, o una pequeña porción de la racha de diploides y raya en el medio selectivo misma para generar colonias aisladas.

Esporulación y la digestión de los ascos
Protocolo

1. Elige colonias aisladas de la placa por encima y hacer pequeños (1 cm x 1 cm) en los parches de esporulación (SPO) placas e incubar a 30 ° C durante 3-7 días a esporas.
2. La esporulación se puede comprobar observando las células de cada parche en un microscopio de luz. Células de lugar en un portaobjetos de 5.10 l de agua, coloque un cubreobjetos en la parte superior de la gota, y buscar la presencia de ascos. Si ascos no son fáciles de encontrar a continuación, poner de nuevo en la incubadora.
3. Si hay esporulación efectiva en uno de los parches, preparar un tubo cónico de 15 ml estéril con 100μL de jugo de tétrada.
4. Recoger las células frente a este parche esporulación con un asa de siembra estéril de 3 mm (células que cubren ¼ del bucle) y el lugar en el jugo de la tétrada. Haga girar suavemente el bucle para permitir que las células se caiga el circuito y mezclar con la solución.
5. Agregar el jugo tétrada (que contiene zymolyase) de 4-10 minutos (dependiendo de la concentración y la actividad de zymolyase y el propio esfuerzo). Esto permite la digestión de la pared celular que rodea el ascosporas.
6. Marque la parte superior e inferior de la región de inóculo en una placa de YPD.
7. Opcional. La reacción puede ser detenida mediante la adición de 1 ml de hielo frío estéril dH ₂ O. Permitir que las células que conformarse con 5 minutos. Retire 1 ml del sobrenadante y mezclar suavemente con la mano y mantener en hielo.
8. Tome 5μL de las células digieren desde el paso 5 y suavemente poner gotas en una línea en la región de inóculo de la placa de YPD pre-marcadas.
9. Use un asa estéril la inoculación de 3 mm para difundir con mucho cuidado los tiempos de 1-3 gotas en una línea, mientras que apenas hacer contacto con el agar.
10. Deje que el líquido se absorba en el agar (Si se omite el paso 7, esto es cuando la digestión de la pared celular externa se reducirá o parada). Continúe con el microscopio de disección.

La disección de Asci
Protocolo

Tenga en cuenta que el siguiente protocolo se describe de un microscopio cantante MSM Sistema de micromanipulación 200. Este protocolo se puede seguir con ligeras modificaciones, si se utiliza un micromanipulador manual como un micromanipulador Zeiss MR.

1. Centrarse en una región de la placa donde la mitad del campo contiene las células y la otra mitad está vacía. Poco a poco poner la aguja en el foco de tal manera que toca la región vacía del campo. Esto asegurará que la aguja no contiene células de un uso anterior. El contacto entre la aguja y el agar es visto como un círculo negro oscuro que poco a poco entra en el foco.
2. Ir a la matriz en la posición A1 y hacer una marca por la perforación del agar de nuevo. Esto es para ayudar a determinar la orientación de la placa si se saca el microscopio antes de su finalización.
3. Cambiar al modo de búsqueda. Localice una ascos. Preferiblemente elija ascos que se encuentran en zonas donde las células están bien hacia fuera. Evite las zonas con grupos de células. Los cuatro ascosporas de un ascos aún debe ser unidas unas a otras. Dos ascosporas pueden ser ligeramente más grande que los otros dos. Evitar la captación de ascos en un ascosporas está suelto y no está conectada con el resto de las ascosporas.
4. Recoger un asco con la aguja. Poco a poco poner la aguja en el plato. Cuando la sombra de las microagujas que se ve, esta línea con el asco para ser recogidos. Nuevo enfoque de la aguja hasta que el contorno negro de un círculo (la punta de la aguja) que se ve. Toque la tétrada con este círculo y rápidamente sacar la aguja. Asegúrese de que los cuatro ascosporas de un asca se han adherido a la aguja y que no hay células adicionales se reunieron en la microaguja que no forman parte de este asco.
5. Tire de la microaguja lejos de la placa e ir a la matriz (por el asco en primer lugar, vaya aposición A1). Tomar nota de cada posición en la que se traslada un asco. Coloque el asco hacia abajo tocando la placa con la microaguja y alejándose hasta que los cuatro ascosporas salir de la microagujas. Suaves golpecitos en el brazo o la aguja de la plataforma que sostiene la placa YPD a menudo es útil en este paso.
6. Repita los pasos 3-5 y lugar ascos abajo en posiciones consecutivas de la matriz hasta el número deseado de ascos han sido recogidos.
7. Volver a cada asca y romper las cuatro celdas separadas por las burlas con la aguja, tocando suavemente la plataforma o una combinación de ambos. Recoger las células dejando uno en una nueva posición en la matriz hasta que cada ascosporas en cada asca se separa en filas de cuatro.
8. Coloque la placa de YPD en una incubadora a 30 ° C durante varios días para observar el patrón de crecimiento.
9. Replica la placa de las células diseccionado a un medio selectivo si es necesario.

Reubicación de los cigotos
Protocolo

1. Racha de dos cepas haploides con los tipos de apareamiento opuesto en el medio apropiado para obtener colonias aisladas.
2. Compañero de estas dos cepas como se describió anteriormente y permitir que crezca de 4 a 6 horas (o toda la noche si es necesario).
3. Compruebe que los cigotos con un microscopio óptico. Cigotos aparecerá como pesas en forma de células, ya sea con o sin raíz.
4. Recoger las células con un asa de siembra de 3 mm (células que cubren ¼ del bucle) y el lugar suavemente en 100μL de agua estéril dH ₂ O.
5. Marque la parte superior e inferior de la región de inóculo en una placa de YPD.
6. Tome 5μL y suavemente poner gotas en una línea en la región de inóculo de la placa de YPD pre-marcadas.
7. Use un asa de siembra de 3 mm se esparzan las gotas en una línea muy suavemente, mientras que apenas hacer contacto con el agar.
8. Deje que el líquido se absorba en el agar. Continúe con el microscopio de disección.
9. Centrarse en una región de la placa donde la mitad del campo contiene las células y la otra mitad está vacía. Poco a poco poner la aguja en el foco de tal manera que toca la región vacía del campo. Esto asegurará que la aguja no contiene células de un uso anterior. El contacto entre la aguja y el agar es visto como un círculo negro oscuro que poco a poco entra en el foco.
10. Ir a la matriz en la posición A1 y hacer una marca por la perforación del agar de nuevo. Esto es para ayudar a determinar la orientación de la placa si se saca el microscopio antes de su finalización.
11. Cambiar al modo de búsqueda. Localizar a un cigoto.
12. Recoger un cigoto con la aguja.
13. Cigotos lugar individual en la matriz.
14. Permita que los cigotos a crecer durante varios días.
15. Placa de réplica de los cigotos en el medio selectivo apropiado.

Resultados representante

Figura 1: El apareamiento de dos cepas haploides de los tipos de apareamiento opuesto genera una cepa diploide.

Figura 2: (A) Una placa de YPD con resultados thre de un cruzamiento entre una cepa sensible a la temperatura (con un auxotrofía leu2) y una cepa de tipo salvaje (LEU2). Las células digieren se distribuyen en la región de inóculo de la izquierda donde se ve el crecimiento de espesor entre las dos líneas de color negro. Ascos que han sido disecados crecen espaciados uniformemente en la matriz de la derecha. (B) La placa en (A) se reprodujo en una SD-leucina de abandono de placas. Tenga en cuenta el crecimiento de 2:02 para el marcador que indica un LEU2 ascosporas validado fue disecada. (C) La placa en (A) se reprodujo en una placa de YPD y se incubaron a 37 º C. Tenga en cuenta el crecimiento de 2:2 que valida aún más que un ascosporas fue disecada.

Disección de la levadura es una herramienta útil para seleccionar nuevas variedades con marcadores deseado. Al determinar el patrón de crecimiento teórico de cuatro ascosporas es importante tener en cuenta el genotipo de la célula vegetativa. Si un plásmido está presente, hay que saber si es solo ejemplar, de baja o alta ya que esto afectará la que las ascosporas (s) recibe el plásmido, y afectará a las predicciones y conclusiones con respecto a las cepas siendo manipulados.

Ciertas cepas pueden esporular mejor que otros producen ascosporas muchas en un corto período de tiempo. Otras cepas sólo puede producir un bajo porcentaje de ascosporas. Esto no tiene ningún efecto en el experimento, siempre y cuando lo suficientemente ascos verdad puede ser seleccionado. Además, las cepas responden de manera diferente durante la digestión de la pared celular y es necesario ajustar empíricamente el tiempo de incubación en el jugo de la tétrada.

Al seleccionar las células con los marcadores que desee, sólo debe elegir las que vienen de una ascos en el patrón de crecimiento de todas las ascosporas se corresponden con el patrón de crecimiento teórico y de una disección en la gran mayoría de todas las ascosporas llevar a la pauta de crecimiento esperado.

El trabajo en el laboratorio del autor está financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la Fundación Canadiense para la Innovación, el de Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación y la Universidad de Concordia.