12.14 : Fluorescencia y fosforescencia: instrumentación

Los fluorómetros y espectrofluorómetros son dos tipos de instrumentos que se utilizan para medir la fluorescencia molecular. Estos instrumentos se diferencian en la forma en que seleccionan las longitudes de onda de excitación y emisión y en el tipo de fuentes de luz que utilizan. Los fluorómetros utilizan filtros de interferencia de absorción para elegir las longitudes de onda de excitación y emisión. La fuente de excitación de un fluorómetro suele ser una lámpara de vapor de mercurio de baja presión que emite líneas intensas distribuidas por las regiones ultravioleta y visible. Si bien los fluorómetros son adecuados para el trabajo cuantitativo y pueden medir la intensidad de la fluorescencia, no pueden registrar los espectros de excitación o emisión.

En cambio, los espectrofluorómetros utilizan un monocromador para seleccionar las longitudes de onda de excitación y emisión. Estos instrumentos emplean una lámpara de arco de xenón de alta presión como fuente de excitación, que produce un espectro de emisión continuo. Los espectrofluorómetros pueden registrar los espectros de excitación o emisión, lo que permite un análisis de fluorescencia más detallado. También son adecuados para mediciones cuantitativas.

En el caso de la fosforescencia molecular, se requiere una instrumentación especializada, conocida como fosforimetría, para discriminar entre fosforescencia y fluorescencia. La fosforescencia tiene una vida útil más larga que la fluorescencia, por lo que se incorpora un retraso entre la excitación y la medición de la emisión fosforescente. Esto se puede lograr utilizando dos cortadores que giran fuera de fase. Los cortadores bloquean la emisión fluorescente cuando la fuente de excitación se enfoca en la muestra y bloquean la fuente de excitación cuando se mide la emisión fosforescente. Para evitar la desactivación del estado excitado por conversión externa, una forma de relajación sin radiación en la que la energía se transfiere al solvente o la matriz de la muestra en lugar de emitirse como luz, las muestras para mediciones de fosforescencia generalmente se disuelven en un solvente orgánico adecuado y se congelan a temperaturas de nitrógeno líquido. Esto forma una matriz sólida ópticamente transparente que minimiza la conversión externa. Alternativamente, la muestra se puede inmovilizar en un sustrato sólido, lo que permite la medición de la fosforescencia a temperatura ambiente.