Die Autoren schätzen die Beratung und technische Unterstützung durch Dr. Richard Konz und Personal an der Durchflusszytometrie-Core Facility sofern an der University of Massachusetts Medical School. Core-Ressourcen durch die Diabetes Endocrinology Research Center Stipendium DK032520 unterstützt wurden ebenfalls verwendet. Diese Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem National Institute of Mental Health (NIMH), das National Institute of Drug Abuse (NIDA) und dem National Institute of Child Health and Human Development unterstützt.

Kerne Extraction <ol><li> Legen Sie 250 mg des gefrorenen postmortem Gehirngewebe in 5 ml Lysepuffer 1 in einem douncer und legen Sie sie auf Eis. So empfangen Sie ca. 5 Millionen Keime nach FACS-Sortierung verwenden wir im allgemeinen 1000 mg Gewebe pro Probe. </li><li> Sobald das Gewebe aufgetaut, Dounce das Gewebe für 1 Minute, während auf dem Eis. </li><li> Nehmen Sie die homogenisierte Gewebe und legen Sie sie in eine 15 ml klare Ultrazentrifuge Röhre. Setzen Sie das Rohr auf dem Eis. </li><li> Nehmen 9 ml Saccharose-Lösung 2 mit einer Pipette, legen Sie die Pipette an der Unterseite des klaren Ultrazentrifuge Rohr, und lassen Sie die Saccharose-Lösung 2 zu einem Konzentrationsgradienten mit dem homogenisierten Gewebe Lösung auf der Oberseite des Saccharose-Lösung 2 zu erstellen. </li><li> Wiegen der Ultrazentrifuge Röhren, um sicherzustellen, dass sie alle werden ausgeglichen, während sich drehenden innerhalb der Ultrazentrifuge werden. Nehmen Sie die Anpassungen, um das Gewicht, indem Lysispuffer 1, um die oberste Schicht. </li><li> Nach dem Röhrchen gewogen wurden, legen Sie sie in den Rotor der Eimer. </li><li> Legen Sie alle Eimer in einen SW28 Rotor und setzt vorsichtig den Rotor in der Ultrazentrifuge. </li><li> Ultrazentrifuge der Proben bei 107163,6 RCF 2,5 Stunden bei 4 ° C. </li><li> Nach der Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand, zusammen mit der Schicht aus Schutt an der Konzentrationsgradient gefunden, mit dem Einsatz von Vakuum, während man aufpassen, nicht das Pellet enthält die Kerne am Boden des Röhrchens zu stören. </li><li> Add 500 mL 1X PBS in jedes Pellet und lassen Sie sich auf dem Eis für 20 Minuten. Dies ermöglicht das Pellet ein wenig auf seine eigene Auflösung, so dass es später leichter mechanisch löse es durch Auf-und Abpipettieren, die verringert die Menge der Stress der Kerne zu erleben. </li><li> Nach der Kerne auf Eis für 20 Minuten haben inkubiert, mechanisch Pipette auf und ab um sich vollständig aufzulösen die Kerne innerhalb 1XPBS. </li><li> Entfernen Sie die Kerne-haltigen Lösung aus der Ultrazentrifuge Rohre und kombinieren Sie die Inhalte von zwei Rohren in einem einzigen 2 mL Reaktionsgefäß. Auch hier legen Sie die Proben auf Eis. </li></ol> Immunfärbung für FACS <ol><li> An dieser Stelle, machen Sie eine Immunfärbung Mischung aus primären und sekundären Antikörpers zusammengesetzt und Blocking Mix. Für jede Probe kombinieren 300 ul 1XPBS mit 1,2 ul der NeuN Antikörper, 100 L Blocking Mix, die 0,5% BSA und 10% normales Ziegenserum in 1XPBS und 1 ul Alexa Fluor 488 enthält. Für den Kontrollproben, schließen Sie die primäre Antikörper NeuN und statt dessen einfach mehr 1XPBS. </li><li> Vortex die Immunfärbung Mischung und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Während die Färbung Mischung inkubiert, um die Steuerelemente für die Proben. Für FACS-Sortierung, eine Probe, die Kerne allein, die so genannte &quot;ungefärbte Kontrolle&quot; notwendig ist, eine zweite Probe, eine negative Kontrolle, welche die Kerne mit dem sekundären Antikörper Alexa Fluor 488, ohne den primären Antikörper NeuN auch benötigt wird. </li><li> Aliquot 20 ul der Kerne enthaltenden Lösung in einem 2 ml Reaktionsgefäß mit 1XPBS für die ungefärbten Kontrolle, und weitere 20 ul in eine andere 2 ml Tube mit 980 uL der 1XPBS für die negative Kontrolle. Erhöhen Sie die Lautstärke der Kerne enthaltenden Probe wieder auf 1 ml mit 1XPBS. Alle Proben sind wieder auf Eis gelegt. </li><li> Nun, da die Immunfärbung Mischung fertig Inkubation, fügen Sie den Inhalt von 401 ul in die entsprechenden Proben. Die Kerne Probe erhalten die Mischung, die sowohl NeuN und Alexa Fluor 488, während die negative Probe der Mischung, die nur den sekundären Antikörper Alexa Fluor 488 erhalten. </li><li> Nehmen Sie die Proben in den kalten Raum im Dunkeln für 45 Minuten zu drehen. </li><li> Nachdem die Proben im Dunkeln für 45 Minuten inkubiert wurden, legte sie auf Eis und bringt sie zu den FACS-Anlage. Während des Transports in der FACS-Anlage, sollten die Proben auf Eis und im Dunkeln gehalten werden. </li></ol> FACS <ol><li> Bei der FACS-Anlage, filtern Sie die Proben durch einen 40 um Filter. Dann führen sie durch das Instrument für ein paar Minuten, während sie kalt gehalten, um einige vorläufige Daten vor dem Sortieren zu bekommen. </li><li> An dieser Stelle ist es notwendig, die entsprechenden Tore für die Sortierung gesetzt werden müssen. Mehrere verschiedene Tore sind zu sortieren Proben verwendet. Das erste Tor gibt eine Vorstellung von der Größe der verschiedenen Kerne in der Probe gefunden, und ermöglicht separatation von Schutt von den tatsächlichen Kernen. Das zweite Tor ermöglicht es uns, Kerne einzeln zu sortieren. Entsorgen Sie alle Aggregate sind an dieser Stelle verworfen. Schließlich ist das dritte Tor zu einer bestimmten Fluoreszenzwellenlänge gesetzt, passend, dass der Fluorochrom in unserem sekundären Antikörper gefunden. Platzieren dieses Tor ermöglicht es uns, zu sortieren und trennen NeuN +, also neuronale Kerne aus NeuN - Kernen. </li><li> Nach all den Toren gewählt sind, können die Kerne in 1XPBS sortiert werden. </li><li> Sobald dergesamte Probe durchlaufen hat, überprüfen Sie die Reinheit der Art, indem Sie einen aliquoten Teil der Probe sortiert durch das Instrument. Stellen Sie sicher, dass die Probe die Fluoreszenz nicht ausgebreitet, sondern in einem einzigen Quadranten enthalten. Am besten ist es Proben, die mehr als 90% rein sind zu wählen. </li></ol> Nach FACS <ol><li> Sobald die Probe wurde sortiert, kann beginnen Verarbeitung der Kerne. Nehmen Sie sich 10 mL Probe sortiert und fügen Sie 2 ml Saccharose-Lösung 2, 50 ul 1 M CaCl 2 und 30 ul von 1m Mg (Ace) 2. Zur Erinnerung: immer sicher sein, um die Probe auf Eis zu halten, da die Kerne unfixierten sind. </li><li> Wenn es weniger als 10 ml sortiert Probe, die Lautstärke zu erhöhen bis zu 10 mL, indem 1XPBS, oder stellen Sie die zusätzlichen Materialien entsprechend. </li><li> Kehren Sie die Probe mehrmals und auf Eis für 15 Minuten. </li><li> Nachdem die Proben auf Eis für 15 Minuten inkubiert, zentrifugiert sie in einer Schaukel Eimer Rotor bei 1786 RCF für 15 Minuten bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand mit dem Einsatz von Vakuum, ohne die weiße Pellet am Boden des Röhrchens gefunden. </li><li> Lösen Sie das Pellet in 200 ul, was für Sie optimalen Lösung für das Verfahren Experimente und Pipette auf und ab. </li><li> Übertragen Sie die Lösung in ein kleineres Rohr und legen Sie sie in die -80 ° C Gefrierschrank bis zur weiteren Verwendung. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons.">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans.">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li><li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10,000+human+cells.">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li></ol>

Das Protokoll hier vorgestellten sollte besonders nützlich für Studien zu epigenetischen Veränderungen der neuronalen Chromatin und ganz allgemein ausgerichtet, auf der molekularen Phänotyp der neuronalen Zellkern, während der normalen Entwicklung und Alterung, oder in neurologischen oder psychiatrischen Erkrankungen. Die Methode ist von besonderem Vorteil, wenn die zelluläre Heterogenität des Hirngewebes, einschließlich der möglichen Verschiebungen in Neuron-to-Glia Ration im Verlauf des Alterns oder wegen Krankheit eine Sorge 1 sind. Zum Beispiel durch die Kombination der gegenwärtigen Sortier-Protokoll mit Chromatinimmunpräzipitation Techniken haben wir vor kurzem beschrieben Neuronen-spezifische Histon-Methylierungsmuster im Gehirn neurotrophen Faktor (BDNF) Gen-Promotor, und für zusätzliche neuronale Gene 2. Eine ähnliche Methode wurde zuvor zu Neuronen aus adulten Großhirnrinde für die retrospektive Geburt datiert 3. Sammeln verwendet. Die Sortierung Technik wurde auch in Maus-Gehirn 2 eingesetzt, und wegen der Stabilität von Atomkernen in frozen-dann-wieder aufgetaut Gewebe, erwarten wir, dass der hier vorgestellte Ansatz für eine breite Palette von Arten ist. Da Chromatinimmunpräzipitation schon ab 10.000 Zellen für ist nun möglich, auch für eine umfassendere Genomabdeckung 4 kann es möglich sein, viel weniger als die 1000 mg des Ausgangsmaterials, dass wir oben empfohlen werden.

Reagenzien: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Lysispuffer </th></tr><tr><td> 0,32 M </td><td> Sucrose </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 ul </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Acetat) 2 </td><td> 150 pl </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 pl </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH 8 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 pl </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit Wasser autoklaviert </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Saccharose-Lösung </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sucrose </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (Acetat) 2 </td><td> 150 pl </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> DTT </td><td> 17 ul </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, pH 8 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Stellen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit Wasser autoklaviert </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce Puffer </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Der pH-Wert auf 7,5 und das Volumen auf 200 ml mit Wasser autoklaviert </td></tr></table>

neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue

Neuronen im menschlichen Gehirn postmitotischen weitgehend geworden während der pränatalen Entwicklung, und behalten so ihre Kerne während der gesamten Lebensdauer. Es ist jedoch wenig über die Änderungen in der neuronalen Chromatin und nukleare Organisation im Laufe der Entwicklung und Alterung, oder bei chronischen neuropsychiatrischen Krankheit bekannt. Doch bis heute die meisten Chromatin und DNA basierenden Tests (außer Fisch) fehlen einzelne Zelle Auflösung. Zu diesem Zweck stellt die erheblichen zellulären Heterogenität des Hirngewebes eine erhebliche Einschränkung, denn in der Regel verschiedene Subpopulationen von Neuronen mit verschiedenen Arten von Gliazellen und anderen nicht-neuronalen Zellen vermischt. Eine mögliche Lösung wäre, Zelltyp-spezifische Kulturen wachsen, aber die meisten ZNS-Zellen, einschließlich Neuronen, sind ex vivo eine nachhaltige, am besten, denn nur ein paar Wochen und somit würde ein unvollständiges Modell für epigenetische Mechanismen potentiell Betriebskosten über die gesamte Lebensdauer liefern . Hier bieten wir ein Protokoll zu extrahieren und zu reinigen Kerne aus gefrorenem (nie fest) menschlichen post mortem Gehirn. Das Verfahren beinhaltet die Extraktion der Kerne in hypotone Lyse-Puffer, durch Ultrazentrifugation und immunotagging mit anti-NeuN-Antikörper. Labeled neuronale Kerne werden dann separat mit Fluoreszenz-aktivierter Sortierung gesammelt. Diese Methode sollte für jede Region des Gehirns in eine Vielzahl von Arten und für Chromatinimmunpräzipitation Studien mit Ort-und Umbau-spezifischen anti-Histon-Antikörper, und für die DNA-Methylierung und andere Assays.

Watch this Scientific Journal Video about Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue at JoVE.com

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Die zellulären Heterogenität von Hirngewebe stellt eine erhebliche Einschränkung für das Studium der epigenetischen Markierungen in Chromatin, da die meisten Assays einzelne Zelle Auflösung fehlt. Neuronen sind typischerweise mit Glia und andere nicht-neuronalen Zellen vermischt. Wir bieten ein Protokoll zu extrahieren und zu sammeln neuronale Kerne von menschlichen Gehirns.

Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.0K Aufrufe.  University of Massachusetts Medical School. Die zellulären Heterogenität von Hirngewebe stellt eine erhebliche Einschränkung für das Studium der epigenetischen Markierungen in Chromatin, da die meisten Assays einzelne Zelle Auflösung fehlt. Neuronen sind typischerweise mit Glia und andere nicht-neuronalen Zellen vermischt. Wir bieten ein Protokoll zu extrahieren und zu sammeln neuronale Kerne von menschlichen Gehirns.

Serie: Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

A Chromatin-Assay für Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Forschung

Biologie

Obtaining High Quality RNA from Single Cell Populations in Human Postmortem Brain Tissue

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression profiles of pyramidal neurons in layer III. It is well known that the cerebral cortex is an exceptionally heterogeneous structure comprising diverse regions, layers and cell types, each of which is characterized by distinct cellular and molecular compositions and therefore differential gene expression profiles. To circumvent the confounding effects of tissue heterogeneity, we used laser-capture microdissection (LCM) in order to isolate our specific cell-type i.e pyramidal neurons.
Approximately 500 pyramidal neurons stained with the Histogene staining solution were captured using the Arcturus XT LCM system. RNA was then isolated from captured cells and underwent two rounds of T7-based linear amplification using Arcturus/Molecular Devices kits. The Experion LabChip (Bio-Rad) gel and electropherogram indicated good quality a(m)RNA, with a transcript length extending past 600nt required for microarrays. The amount of mRNA obtained averaged 51&mu;g, with acceptable mean sample purity as indicated by the A260/280 ratio, of 2.5. Gene expression was profiled using the Human X3P GeneChip probe array from Affymetrix.

We describe a process using laser-capture microdissection to isolate and extract RNA from a homogeneous cell population, pyramidal neurons, in layer III of the superior temporal gyrus in postmortem human brains. We subsequently linearly amplify (T7-based) mRNA, and hybridize the sample to the Affymetrix human X3P microarray.

Beziehen High Quality-RNA aus Einzel-Zellpopulationen in menschlichen Postmortem Gehirngewebe

We proposed to investigate the gray matter reduction in the superior temporal gyrus seen in schizophrenia patients, by interrogating gene expression ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Affinity-basierte Isolierung von Tagged Kerne aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Tücher für Genexpressionsanalyse

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are found in mammalian cells. These small RNAs are potent gene regulators controlling vital pathways such as growth, development and death and much interest has been directed at their expression in bodily fluids. This is due to their dysregulation in human diseases such as cancer and their potential application as serum biomarkers. However, the analysis of miRNA expression in serum may be problematic. In most cases the amount of serum is limiting and serum contains low amounts of total RNA, of which small RNAs only constitute 0.4-0.5%1. Thus the isolation of sufficient amounts of quality RNA from serum is a major challenge to researchers today. In this technical paper, we demonstrate a method which uses only 400 &#181;l of human serum to obtain sufficient RNA for either DNA arrays or qPCR analysis. The advantages of this method are its simplicity and ability to yield high quality RNA. It requires no specialized columns for purification of small RNAs and utilizes general reagents and hardware found in common laboratories. Our method utilizes a Phase Lock Gel to eliminate phenol contamination while at the same time yielding high quality RNA. We also introduce an additional step to further remove all contaminants during the isolation step. This protocol is very effective in isolating yields of total RNA of up to 100 ng/&#181;l from serum but can also be adapted for other biological tissues.

This protocol describes a method for extracting small RNAs from human serum. We have used this method to isolate microRNAs from cancer serum for use in DNA arrays and also singleplex quantitative PCR. The protocol utilizes phenol and guanidinium thiocyanate reagents with modifications to yield high quality RNA.

Isolierung von Kleine-kodierenden RNAs von Human Serum

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

RNA-Isolierung aus Maus Pankreas: Eine Ribonuklease-reichen Gewebe

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Y-27632 Bereichert die Ausbeute menschlicher Melanozyten aus erwachsenen Hautgeweben

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Quantitative Proteomics Workflow using Multiple Reaction Monitoring Based Detection of Proteins from Human Brain Tissue

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related disorders continue to be a major contributor of deaths around the world, necessitating the need for even greater understanding of their pathobiology. Traditional antibody-based techniques like western blotting or immunohistochemistry suffer from being low-throughput besides being labor-intensive and qualitative or semi-quantitative. Even conventional mass spectrometry-based shotgun approaches fail to provide conclusive evidence to support a certain hypothesis. Targeted proteomics approaches are largely hypothesis driven and differ from the conventional shotgun proteomics approaches that have been long in use. Multiple reaction monitoring is one such targeted approach that requires the use of a special mass spectrometer called the tandem quadrupole mass spectrometer or triple quadrupole mass spectrometer. In the current study, we have systematically highlighted the major steps involved in performing a successful tandem quadrupole mass spectrometry-based proteomics workflow using human brain tissue with an aim to introduce this workflow to a broader research community.

The protocol aims to introduce the use of a triple quadrupole mass spectrometer for Multiple Reaction Monitoring (MRM) of proteins from clinical samples. We have provided a systematic workflow starting from sample preparation to data analysis for clinical samples with all the necessary precautions to be taken.

Quantitativer Proteomik-Workflow mit multipler Reaktionsüberwachung basierender Detektion von Proteinen aus menschlichem Hirngewebe

The proteomic analysis of the human brain tissue over the last decade has greatly enhanced our understanding of the brain. However, brain related ...

Nuclei Isolation from Adult Mouse Kidney for Single-Nucleus RNA-Sequencing

The kidneys regulate diverse biological processes such as water, electrolyte, and acid-base homeostasis. Physiological functions of the kidney are executed by multiple cell types arranged in a complex architecture across the corticomedullary axis of the organ. Recent advances in single-cell transcriptomics have accelerated the understanding of cell type-specific gene expression in renal physiology and disease. However, enzyme-based tissue dissociation protocols, which are frequently utilized for single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq), require mostly fresh (non-archived) tissue, introduce transcriptional stress responses, and favor the selection of abundant cell types of the kidney cortex resulting in an underrepresentation of cells of the medulla.
Here, we present a protocol that avoids these problems. The protocol is based on nuclei isolation at 4 &#176;C from frozen kidney tissue. Nuclei are isolated from a central piece of the mouse kidney comprised of the cortex, outer medulla, and inner medulla. This reduces the overrepresentation of cortical cells typical for whole-kidney samples for the benefit of medullary cells such that data will represent the entire corticomedullary axis at sufficient abundance. The protocol is simple, rapid, and adaptable and provides a step towards the standardization of single-nuclei transcriptomics in kidney research.

Here, we present a protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mouse kidneys that improve the representation of medullary kidney cell types and avoids the gene expression artifacts from enzymatic tissue dissociation.