Dieses Projekt wurde von einem Leon J. Thal SEED Zuschuss aus dem California Institute for Regenerative Medicine unterstützt. Tobias Henning wurde durch eine Forschung von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HE 4578/1-2) Stipendium finanziert. Wir wollen danken Juanito Meneses für seine Beratung auf die Kultur von humanen embryonalen Stammzellen.

Kennzeichnung von mesenchymalen Stammzellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff DiD <ol><li> Zu Beginn des Verfahrens zur Kennzeichnung mesenchymale Stammzellen, trypsinize und zählen Sie die Zellen, um eine Suspension mit einer definierten Anzahl von Zellen erhalten. </li><li> Nehmen Sie die Zellen aus dem Inkubator und saugen aus alten Medien von den Flaschen mit den Zellen markiert werden </li><li> Waschen Sie die Zellen mit 10 ml Mg / Ca-freiem PBS. Saugen Sie die PBS. Die Mg-und Ca würde hemmen die Trypsin, deshalb verwenden wir PBS ohne diese. </li><li> Add vorgewärmten 0,05% Trypsin, für eine T75-Kolben verwenden wir 5ml. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Oberfläche des Kolbens bedeckt ist. </li><li> Bei 37 ° C im Brutschrank für ca. 5 Minuten. </li><li> Bestätigen Sie die Ablösung unter dem Mikroskop. Wenn die Zellen noch in den Kolben halten, tippen Sie es ein paar Mal und warten Sie ein wenig länger, bis die Trypsinierung erfolgreich ist. </li><li> Nun ist es notwendig, die Trypsin durch Zugabe von Medium mit 10% FCS zu neutralisieren. Wir verwenden die gleiche Menge von Medien, da es Trypsin. </li><li> Pipette nach oben und unten ein paar Mal, um sicherzustellen, dass alle Zellen in den Medien erneut suspendiert. </li><li> Übertragen Sie die Zell-Lösung zu einer sterilen 15ml capped Polypropylenröhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 400 rcf für 5 Minuten. </li><li> Absaugen aus dem Überstand die Gewährleistung nicht auf das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendieren der Zellen in DMEM und fahren Sie mit der Zellzahl. </li><li> Suspend die Zellen bei einer Dichte von 1x10 gekennzeichnet sein ^ 6 pro ml in serumfreiem Kulturmedium (DMEM). </li><li> Das war alles Vorbereitung der Zellsuspension. Nun ist es bereit, die Kennzeichnung zu starten. </li><li> Fügen Sie zuerst 5 ul DiD Kontrastmittel pro ml Zellsuspension. </li><li> Dann mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen mit der Beschriftung Lösung bei 37 ° C für 20 Minuten in einer 6-well low-Anlage Gericht. </li><li> Sobald die einfache Inkubation abgeschlossen ist, ist es notwendig, die Zell-Lösung in ein 15 ml Polypropylen-Röhrchen verschlossen zu übertragen. </li><li> Centrifuge es sich bei 400 rcf für 5 Minuten. </li><li> Saugen Sie die Kennzeichnung Medium, wodurch nicht Zellpellet stören. </li><li> Waschen Sie die Zellen mit PBS. Pipette die Zellen auf und ab, und achten Sie darauf brechen die Zellpellet. </li><li> Wiederholen Sie die letzten beiden Schritte noch zwei weitere Male, so dass es insgesamt 3 Waschschritte. </li><li> Zählen Sie die Zellen und führen Sie eine Trypanblau-Test, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Dies sind Standard-Zellkultur-Protokolle, dass wir nicht hier zu erklären. </li><li> Ihre Zellen sind nun bereit, in der optischen Imager abgebildet werden. </li></ol> Kennzeichnung von humanen embryonalen Stammzellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff ICG <ol><li> Zu Beginn des Verfahrens zur Kennzeichnung menschlicher embryonaler Stammzellen, bereiten das Kontrastmittel Indocyaningrün. Mischen Sie es mit der Transfektionsagens Protamin. </li><li> Messen Sie 1mg der Indocyaningrün Pulver. Lösen Sie die ICG-Pulver in 100 ul Dimethylsulfoxid (DMSO). </li><li> Add 400 ul Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM + 10% fötales Kälberserum) Medien auf die Mischung und schütteln Sie sie gut. Dies führt zu einer finalen Konzentration von 2mg/ml von Indocyaningrün. </li><li> Fügen Sie die Transfektionsagens Protamin. Protamin fungiert als Shuttle für das Kontrastmittel, so dass es in die Zelle wird effizienter. </li><li> Mix 5 ul Protaminsulfat, die bei einer Konzentration von 10mg/ml geliefert wird, mit 300 ul ICG und 300 ul serumfreiem Dulbeccos Modified Eagles Medium. </li><li> Schütteln Sie die neue Transfektion Lösung für 5 Minuten, damit komplexe zu bilden. </li><li> Die Kennzeichnung Lösung bereit ist. </li><li> Saugen Sie die alten Medien von hES-10mm Petrischale. </li><li> Add 5 ml vorgewärmten serumfreien DMEM. </li><li> Fügen Sie die zuvor vorbereiteten Protamin / ICG-Lösung zu den Zellen. Starten Sie die 1 Stunde Inkubation, indem das Gericht in einem Brutschrank bei 37 ° C. </li><li> Nach der Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Schale aus dem Inkubator und saugen die Kennzeichnung Lösung. </li><li> Waschen Sie die Zellen durch Spülen der Teller mit 5 ml PBS. </li><li> Saugen Sie die PBS und ersetzen mit 5 ml 0,25% Trypsin. Inkubieren Sie die Schale bei 37 ° C für 5 Minuten, damit Trypsinierung auftreten. Es hilft, die Schüssel ein wenig hin und wieder schütteln in eine Weile. </li><li> Gently Pipette auf und ab, brechen die restlichen Kolonien. </li><li> Neutralisieren Sie die Trypsin durch Zugabe einer gleichen Menge von KSR, die Schüssel. </li><li> Übertragen Sie die Zelle Lösung für ein 15ml Tube und zentrifugieren die Lösung bei 400 rcf für 5 Minuten. </li><li> Resuspendieren der Zellen in voller Medien. </li><li> Wenn es noch Klumpen an dieser Stelle sind, trypsinize und Zentrifuge wieder. </li><li> Sobald ein Klumpen-freie Zelle Lösung erreicht wird, saugen aus den alten Medien und das Pellet in 10 ml vorgewärmten volle ESC-Medien. </li><li> An dieser Stelle ist es notwendig, die Maus Feeder-Zellen aus dem hESCs trennen. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass später, tritt nur die Abbildung der Stammzellen. </li><li> Dazu übertragen the Zelle Lösung eines Gelatine beschichtete 10 cm Schüssel. </li><li> Setzen Sie die Schüssel in die 37 ° C Inkubator und lassen Sie ihn 45 Minuten lang sitzen. Während dieser Zeit, stellen Sie sicher nicht auf den Teller zu stören. Nun werden die Anleger, die Schüssel halten und die Stammzellen nicht. </li><li> Übertragen Sie die Lösung aus der Petrischale. und jetzt haben wir einen markierten Einzelzellen Lösung von menschlichen embryonalen Stammzellen. </li><li> Die Zellen können nun gezählt werden und eine Trypanblau-Test kann an ihnen durchgeführt werden. </li><li> Die Zellen sind bereit, die abgebildet werden! </li></ol>

<ol>
	<li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+tracking+with+Gadophrin-2+--+a+bifunctional+contrast+agent+for+MR+imaging,+optical+imaging+and+fluorescence+microscopy.">Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).</li><li>Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+experimental+arthritis+using+allogeneic+leukocytes+labeled+with+a+near-infrared+fluorescent+probe.">Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe.</a> Eur J Nucl Med &amp; Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).</li><li>Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Tracking+with+Optical+imaging.">Cell Tracking with Optical imaging.</a> Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).</li><li>Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+multichannel+near+infrared+endoscope+for+mouse+imaging.">Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging.</a> Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).</li></ol>

OI ist ein relativ neues bildgebendes Verfahren, basierend auf der Detektion von Fluoreszenz. OI ist so sensibel wie Radiotracer-basierten Imaging-Techniken, aber nicht mit einer Bestrahlung Exposition verbunden. OI stellt ein wirksames Mittel zur Verfolgung Zellen nicht-invasiv und wiederholt damit einen Einblick in die Zellwanderung an den Zielort. Eine wichtige Einschränkung der Technik ist die begrenzte Eindringen in das Gewebe von fluoreszierenden Sonden in vivo. So ein Tracer Akkumulation im tiefen Gewebe, mehr als etwa 5-10 cm von der Hautoberfläche, kann nicht erkannt werden. Aktuelle klinische Anwendungen sind oberflächliche Techniken wie endoskopische, Herz-Kreislauf-und retinae Bildgebung (Funovics et al. 2003) beschränkt, sondern dieser Bereich der Forschung wird auch weiterhin durch die Anerkennung der großen Möglichkeiten, die durch in vivo Zell-Tracking erweitern.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Indocyanine Green (IR-125)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>AC41254-1000 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMSO</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D-2650 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-MEM High Glucose </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5648</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gelatin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1890</td>
<td>Dilute to final concentration of 0.1% in PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS, Mg and Ca free</td>
<td>Reagent</td>
<td>GIBCO </td>
<td>14190-144</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA 0.05% </td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300-120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA 0.25% </td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-114	</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FCS, characterized</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hyclone</td>
<td>SH30071.03</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Strainer (40 &#x03BC;m Nylon)</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>352340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DiD</td>
<td>Reagent</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>V-22887</td>
<td>
</td>
</tr>
<tr>
<td>Knockout DMEM</td>
<td>Reagent</td>
<td>GIBCO</td>
<td>10829018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Knockout Serum Replacer</td>
<td>Reagent</td>
<td>GIBCO</td>
<td>10828028</td>
<td>
</td>
</tr>
<tr>
<td>b-Mercaptoethanol </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>7522</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Non-essential Amino Acids </td>
<td>Reagent</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11140050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>FGF-2</td>
<td>Reagent</td>
<td>R&D Systems </td>
<td> 233-FB-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamine 200mM </td>
<td>Reagent</td>
<td>GIBCO</td>
<td>25030081</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>Reagent</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine Sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>American Pharmaceutical Partners Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

labeling stem cells with fluorescent dyes for non-invasive detection with optical imaging

Optical Imaging (OI) ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Werkzeug zur In-vivo-Überwachung der neuen Stammzell-basierten Therapien. Die Technik basiert auf ex vivo-Markierung von Stammzellen mit einem fluoreszierenden Farbstoff, anschließende intravenöse Injektion der markierten Zellen und Visualisierung ihrer Anreicherung in bestimmten Zielorganen oder Pathologien basiert. Die vorgestellte Technik zeigt, wie wir von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) Etikett durch einfache Inkubation mit dem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff DiD (C67H103CIN2O3S) und wie wir humanen embryonalen Stammzellen (hES) Etikett mit der FDA zugelassen Fluoreszenzfarbstoff Indocyaningrün (ICG). Die Aufnahme-Mechanismus erfolgt über die Einhaltung und Verbreitung der lipophilen Farbstoff in die Phospholipid-Doppelschicht der Zellmembran. Die Kennzeichnung Effizienz ist in der Regel verbessert werden, wenn die Zellen mit dem Farbstoff in serum-freien Medien als der Inkubation in Serum-haltigen Medien Gegensatz bebrütet werden. Darüber hinaus ist der Zusatz des Transfektionsagens Protaminsulfat deutlich verbessert Kontrastmittelaufnahme.

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Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Dieses Video zeigt Techniken für die Kennzeichnung von menschlichen embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Technik kann für eine in vivo Verfolgung der transplantierten Stammzellen mit optischen Bildgebung und zur histopathologischen Korrelation mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden.

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

labeling-stem-cells-with-fluorescent-dyes-for-non-invasive-detection

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.3K Aufrufe.  Contrast Agent Research Group at the Center for Molecular and Functional Imaging, Department of Radiology, University of California San Francisco. Dieses Video zeigt Techniken für die Kennzeichnung von menschlichen embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Technik kann für eine in vivo Verfolgung der transplantierten Stammzellen mit optischen Bildgebung und zur histopathologischen Korrelation mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden.

Serie: Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Forschung

Biologie

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Nicht-invasive 3D-Visualisierung mit Sub-Mikron-Auflösung mit Synchrotron-Röntgen-Tomographie

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Richtige Pflege und Reinigung des Mikroskops

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

Zusammenfassung

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Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

Nicht-invasive 3D-Visualisierung mit Sub-Mikron-Auflösung mit Synchrotron-Röntgen-Tomographie

In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Richtige Pflege und Reinigung des Mikroskops

Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine für Multiplex-Anwendungen

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

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Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

Nicht-invasive 3D-Visualisierung mit Sub-Mikron-Auflösung mit Synchrotron-Röntgen-Tomographie

In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Richtige Pflege und Reinigung des Mikroskops

Phasenkontrast und Differential Interferenz Kontrast (DIC) Mikroskopie

Visualisierung der Live- Drosophila Glial-neuromuskulären Synapse mit Fluoreszenzfarbstoffen

Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures

Lineage Kennzeichnung von Zebrafisch-Zellen mit Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine ​​für Multiplex-Anwendungen

Genetische Barcoding mit Fluoreszierende Proteine für Multiplex-Anwendungen