Unsere multidisziplinäre Gruppe versucht zu verstehen, wie ein infektiöses Protein, ein Prion, komplexe biologische Aufgaben erfüllen kann. Wir interessieren uns auch dafür, wie Prionen über Jahre bis Jahrzehnte in der Umwelt überleben können. Nach Prionen-Dekontaminationsverfahren stand keine robuste Methode zur Bestimmung der Wirksamkeit der Prioneninaktivierung zur Verfügung.
Wir versuchen, dieses Problem mit unserer Forschung anzugehen. Die Abstrichmethode, gekoppelt mit RT-QuIC, ermöglicht die Probenahme einer Vielzahl von Oberflächen, um die Aussaat von Prionen zu erkennen. Dies kann zum Nachweis von oberflächenassoziierten Prionen in Labor-, klinischen oder Umweltumgebungen verwendet werden.
Ich bin daran interessiert zu verstehen, wie Prionen mit Oberflächen interagieren und welche Anforderungen oberflächengebundene Prionen haben, um eine Infektion zu etablieren. Identifizieren und kennzeichnen Sie zunächst geeignete Überwachungsbereiche für den Abstrich. Bereiten Sie zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jeden identifizierten Bereich vor und geben Sie 250 Mikroliter DPBS in das erste Röhrchen, während das zweite leer bleibt.
Entnehmen Sie mit Schaumstoff bestückte Tupfer aus der Lagerung in einem Bereich, der frei von Prionenverunreinigungen ist. Die Positiv- und Negativkontrollen sind mit geeigneten Gehirnhomogenaten oder BH in DPBS vorzubereiten. Nehmen Sie mit sauberen Handschuhen die erforderliche Anzahl von Schaumtupfern aus der Verpackung und legen Sie sie mit dem Griff nach unten in ein Röhrchengestell.
Stellen Sie sicher, dass die Spitzen nicht mit anderen Oberflächen in Berührung kommen. Halten Sie einen sauberen Schaumtupfer am Griff und geben Sie 50 Mikroliter der jeweiligen Positiv- und Negativkontrollproben auf die Tupferspitzen. Schneiden Sie mit einer Schere den überschüssigen Griff des Tupfers auf etwa die Hälfte seiner Länge ab und legen Sie den Tupfer in das vorgeladene Mikrozentrifugenröhrchen, um die Schaumstoffspitze in DPBS einzutauchen.
Halten Sie einen sauberen Schaumstofftupfer am Griff, befeuchten Sie die Schaumstoffspitze mit molekularem Wasser und schütteln Sie das überschüssige Wasser ab. Legen Sie die angefeuchtete Schaumspitze auf die für die Überwachung gewählte Stelle und wischen Sie die Stelle ca. 10 Mal hin und her, während Sie gleichzeitig die Tupferspitze auf der Oberfläche drehen. Schneiden Sie mit einer Schere den überschüssigen Griff des Tupfers auf etwa die Hälfte seiner Länge ab und legen Sie den Tupfer in das vorgeladene Mikrozentrifugenröhrchen, um die Schaumstoffspitze in DPBS zu tauchen und sicherzustellen, dass sich der Deckel vollständig schließen kann.
Entsorgen Sie Handschuhe und ersetzen Sie sie durch neue, bevor Sie zur nächsten Abstrichstelle gehen, um Kreuzkontaminationen zu minimieren. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen für die Tupferextraktion in ein kreisförmiges Röhrchengestell und tauchen Sie das Gestell in das Becherhorn-sonicater-Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass sich der Schaumtupfer in DPBS im Röhrchen unter der Wasseroberfläche befindet und die Griffteile nicht untergetaucht sind.
Beschallen Sie die Probe insgesamt 15 Sekunden lang, wobei die Zyklen fünf Sekunden lang ein- und fünf Sekunden ausgeschaltet werden. Nach der Beschallung zentrifugieren Sie das Röhrchen etwa 15 Sekunden lang, um das DPBS am Boden des Röhrchens vor dem Transfer zu sammeln. Sammeln Sie mit einer auf 250 Mikroliter eingestellten Pipette P 1000 vorsichtig den gesamten flüssigen Tupferextrakt vom Boden in das entsprechende vorbeschriftete leere Röhrchen.
Entsorgen Sie das gebrauchte Röhrchen mit dem Tupfer. Konzentrieren Sie die Probe in einem Vakuumkonzentrator, stellen Sie sicher, dass der Röhrchendeckel geöffnet ist, und stellen Sie nach Abschluss des Zyklus sicher, dass die Probe vollständig konzentriert ist und nur noch ein Pellet übrig bleibt. Lagern Sie das Pellet bis zur weiteren Verwendung bei minus 80 Grad Celsius.
Für die RT-QuIC-Analyse bereiten Sie eine Negativ- und eine Positivplattenkontrolle mit entsprechenden Gehirnhomogenaten vor, die in Gewebeverdünnungslösung verdünnt sind. Tauen Sie nun das gelagerte Tupferextrakt-Pellet aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank auf und resuspendieren Sie den getrockneten Tupferextrakt durch Pipettieren mit 50 Mikrolitern Wasser in molekularer Qualität. Kurz vortexen und die Probe bei Raumtemperatur ruhen lassen.
Laden Sie zwei Mikroliter Negativ- und Positivplattenkontrollen, gefolgt von Tupferextrakten, in die jeweiligen RT-QuIC-Plattenvertiefungen. Negative Kontrolltupfer überschritten die positive Fluoreszenzschwelle nicht, was bestätigt, dass während der Eingriffe keine Kontamination stattgefunden hat. Positivkontroll-Tupferextrakte zeigten eine konsistente Aussaat in allen Replikatvertiefungen, was eine angemessene Nachweisempfindlichkeit zeigt.
Oberflächenabstrichproben aus nicht kontaminierten Gebieten zeigten keine Aussaat oberhalb des Schwellenwerts, was die Prionennegativität bestätigt. Prionenkontaminierte Oberflächen wiesen eine Aussaat oberhalb des Schwellenwerts mit unterschiedlichen maximalen Punktverhältnissen und Fluoreszenzzeiten im Vergleich zu Kontrollen auf. Mit Bleiche behandelte Prionen-kontaminierte Oberflächen konnten RT-QuIC nicht aussäen, was eine wirksame Desinfektion zeigt.
Einige Oberflächenartefakte wiesen veränderte kinetische Kurven und längere Fluoreszenzzeiten auf, was auf mögliche falsch positive Ergebnisse hindeutet, wahrscheinlich aufgrund des Vorhandenseins von Staub oder Rückständen von Chemikalien auf einer Oberfläche.
