Unsere Forschung konzentriert sich vor allem auf den Zusammenhang zwischen DNA-Reparatur und Alterung. Konkret schauen wir uns verschiedene Erkrankungen der Laminopathie an und wollen lernen, wie sie sich auf die DNA-Reparatur auswirken können. Wir haben gezeigt, dass eine laminopathische Störung, die mit vorzeitigem Altern und kurzer Lebenserwartung einhergeht und als Hutchinson-Gilford-Progerie-Syndrom bekannt ist, tatsächlich mit einer erhöhten Menge an DNA-Schäden und einer ungenauen DNA-Reparatur verbunden ist.
Unser Labor möchte die Wirkung potenzieller Therapien für Laminopathie-Patienten untersuchen, um zu erfahren, ob diese Ansätze auch einen positiven Einfluss auf die DNA-Reparatur und DNA-Schäden haben. Legen Sie zunächst mit einer Pinzette einen Deckschlicker in jede Vertiefung einer sterilen 6-Well-Platte. Geben Sie zwei Milliliter ergänztes Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) in jede Vertiefung in der 6-Well-Platte.
Das Medium wird aus den im Kolben kultivierten HeLa-Zellen aspiriert und die Zellen durch Zugabe von 15 Millilitern PBS gewaschen. Schwenken Sie den Kolben vorsichtig, um die Zellen zu waschen, aspirieren Sie das PBS und fügen Sie zwei Milliliter Trypsin-EDTA hinzu, um die Zellen zu beschichten. Legen Sie den mit Trypsin beschichteten Kolben für zwei Minuten in einen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator, damit sich die Zellen ablösen können.
Geben Sie dann acht Milliliter supplementiertes DMEM in den Kolben mit den trypsinisierten Zellen und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um die klumpenden Zellen zu trennen. Die Zellsuspension aus dem Kolben wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen aus Polystyrol gegeben. Geben Sie nach dem Zählen der Zellen 500.000 Zellen Tropfen für Tropfen direkt auf die Deckgläser in der 6-Well-Platte.
Stellen Sie die Platte in einen 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid befeuchteten Inkubator, damit die Zellen über Nacht wachsen können. Für die Zellfixierung aspirieren Sie das Medium am nächsten Tag aus den Vertiefungen der 6-Well-Platte. Geben Sie zwei Milliliter PBS in jede Vertiefung, um die Zellen zu waschen, und saugen Sie alle PBS vollständig aus den Vertiefungen ab.
Geben Sie dann zwei Milliliter 4%ige Formaldehydlösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur in jede Vertiefung und saugen Sie die Lösung vollständig aus den Vertiefungen ab. Geben Sie als Nächstes zwei Milliliter Permeabilisierungslösung in jede Vertiefung. Lassen Sie die Lösung 10 Minuten bei Raumtemperatur ziehen und ziehen Sie sie dann vollständig ab.
Waschen Sie die Zellen dreimal mit zwei Millilitern PBS in jeder Vertiefung. Nach jeder Wäsche vollständig absaugen. Sobald das gesamte PBS aus den Vertiefungen aspiriert wurde, fügen Sie zwei Milliliter Antikörperverdünnungspuffer (ADB) zu jeder Vertiefung hinzu, um die Zellen für die Immunfluoreszenzfärbung zu blockieren.
30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schwingen inkubieren. Gegen Ende der Sperrfrist. Bereiten Sie die Verdünnung des Primärantikörpers vor, indem Sie Lumen B1 und doppelsträngige DNA-Antikörper in ADB mischen.
Am Ende der Inkubation saugen Sie das ADB aus den Vertiefungen an. Kleben Sie ein Stück Paraffinfolie auf eine ebene Fläche und stellen Sie sicher, dass die Fläche groß genug ist, um alle zu verarbeitenden Deckgläser aufzunehmen. Pipettieren Sie für jedes Deckglas 75 Mikroliter der Primärantikörperverdünnung auf den Paraffinfilm, wobei Blasenbildung vermieden werden müssen.
Legen Sie mit einer Pinzette jede Hülle mit der Zellseite nach unten auf das Antikörpertröpfchen. Decken Sie die Inkubationsgläser mit dem Deckel der 6-Well-Platte ab und lassen Sie die Deckgläser eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie dann mit einer Pinzette vorsichtig die Deckgläser von der Paraffinfolie und legen Sie sie mit der Zellseite nach oben wieder in die 6-Well-Platte.
Waschen Sie die Deckgläser, indem Sie sie fünf Minuten lang dreimal mit zwei Millilitern PBST schütteln. Bereiten Sie während der abschließenden Wäsche die sekundäre Antikörperverdünnung vor. Nach der letzten Wäsche PBST vollständig absaugen.
Geben Sie einen Sekundärantikörper auf den Para-Film und legen Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach unten auf den Paraffinfilm. Legen Sie dann eine leichte Schutzhülle über die Deckgläser, um die Zellen vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Deckgläser von der Paraffinfolie und legen Sie sie wieder in die 6-Well-Platte, wobei Sie sicherstellen, dass die Zellseite nach oben zeigt. Entwässern Sie dann die Deckgläser, indem Sie nacheinander zwei Milliliter 70 %90 % und 100 % Ethanol in die Vertiefungen geben, wobei Sie jede Lösung ein bis zwei Minuten ruhen lassen, bevor sie entfernt werden.
Entfernen Sie mit einer Pinzette die Deckgläser aus den Vertiefungen und legen Sie sie auf ein fusselfreies Tuch, um sie lichtgeschützt an der Luft trocknen zu lassen. Montieren Sie die Deckgläser mit der Zellseite nach unten auf Glasobjektträger mit 20 Mikrolitern Eindeckmedium pro Deckglas. Kernblebbing war in HeLa-ZMPST24-Knockout-Zellen häufiger, wobei etwa 50 % der Zellkerne Blabs aufwiesen, verglichen mit 17 % in HeLa-Kontrollzellen.
DNA-Leckagen wurden überwiegend in HeLa-ZMPSTE24-Knockout-Zellen beobachtet, während in HeLa-Kontrollzellen keine DNA-Leckage beobachtet wurde, trat in einigen ZMPSTE24 Knockout-Zellen DNA-Lecks auf, selbst wenn kein sichtbares Kernblebbing auftrat.
