Im Morhardt Lab verwenden wir den Zebrafisch als Tiermodell, um die Entwicklung und Funktion der Blase zu untersuchen. Wir haben eine funktionsfähige Harnblase identifiziert, die sich im Zebrafisch füllt und entleert. Obwohl Zebrafische klein sind, haben wir versucht, ihre Größe zu nutzen, um räumliche Transkriptomtechniken und unser Verständnis der Wirbeltierblase wirtschaftlich zu nutzen.
Räumliche Transkriptomtechniken können schnell teuer werden, wenn Reagenzien und Geräte nicht optimiert werden. Dieses Protokoll bietet eine bewährte Technik, um dies mit Zebrafischen zu erreichen, und bietet Einblicke in die erwarteten Ergebnisse und die Milderung von Problemen, die durch die Technologie auftreten können. Neben der wirtschaftlichen Nutzung teurer räumlicher Transkriptomtechnologien hat uns diese Arbeit ermöglicht, groß angelegte räumliche Transkriptomanalysen von im Wesentlichen ganzen Organen über mehrere Altersgruppen hinweg durchzuführen und gleichzeitig Batch-Effekte zu minimieren.
Kühlen Sie den Kryostaten zunächst auf 22 Grad Celsius ab und sammeln Sie alle erforderlichen Gegenstände. Bereiten Sie eine Einweg-Kunststoffform für die Probenausrichtung vor. Legen Sie ein Stück Laborband auf die Innenseite der Grundform und zeichnen Sie eine gerade Linie mit einem Permanentmarker als Referenzpunkt darüber.
Markieren Sie die Innenseite der Grundform, um die richtige Ausrichtung der Probe während des Kryoschnitts sicherzustellen. Nachdem Sie die Düse der Gefriermittelflasche grundiert haben, geben Sie die erforderliche Menge in eine Ecke der Grundform. Kippen Sie die Grundform langsam, um das Medium gleichmäßig zu verteilen.
Lege nun die Grundform mit dem Gefriermedium in ein Eisbad und inkubiere sie mindestens 10 Minuten lang, um das Medium abzukühlen. Geben Sie anschließend einen Teil 100 % Ethanol zu einem Teil Trockeneis in einen Eiskübel unter dem Abzug. Stellen Sie die Einweg-Aluminiumschale oder das Einwegboot in das Eisbad und decken Sie den Eimer fünf bis 10 Minuten lang ab.
Sammeln Sie die eingeschläferten Fische, nachdem Sie sie 10 Minuten lang in vier Grad Celsius heißes Wasser getaucht haben. Fassen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze die Schwanzflosse, um den Fisch zu entfernen, und drücken Sie ihn vorsichtig gegen ein saugfähiges, fusselfreies Tuch, um ihn zu trocknen. Legen Sie die vorbereitete Grundform unter ein Stereomikroskop mit 10-facher Vergrößerung.
Positionieren Sie die Probe in der Form entlang des Referenzpunkts in der richtigen Ausrichtung. Decken Sie die Probe vorsichtig mit einer weiteren dünnen Schicht Gefriermedium ab. Verwenden Sie einen anatomischen Referenzpunkt, um den Fisch genau an den markierten Linien in der Grundform auszurichten, und passen Sie die Ausrichtung mit einer feinen Pinzette an, um Blasen zu vermeiden.
Tragen Sie ein Stück Trockeneis auf den Boden der Basisform unter der Probe auf, bis sie lokal eingefroren ist. Halten Sie eine waagerechte horizontale Ebene ein, um eine Fehlausrichtung der Probe vor dem vollständigen Einfrieren zu vermeiden. Legen Sie nun die Grundform mit der Probe auf das Aluminiumschiffchen oder die Schale in das Trockeneis- und Ethanolbad.
Stellen Sie sicher, dass das Boot an der Oberfläche schwimmt und die Grundform trocken bleibt. Decken Sie das Bad ab und lassen Sie die Proben 10 Minuten lang einfrieren. Wickeln Sie anschließend die gefrorene Grundform in Folie ein und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank bei 80 Grad Celsius, bis sie zum Schneiden bereit ist.
Bringen Sie die gefrorene Basisform für die Kryosektion in den vorgekühlten Kryostaten und legen Sie sie in die Kryostatenkammer. Nachdem Sie den Objektträger für die räumliche Bildgebung aus dem Lager genommen haben, legen Sie ihn in einen vorgekühlten Objektträgerhalter. Lagern Sie den Objektträgerhalter mit dem Objektträger für die räumliche Bildgebung in der 22 Grad Celsius heißen Kryostatenkammer, bis er für die Schnittentnahme bereit ist.
Nehmen Sie nun die gefrorene Probe aus der Grundform und legen Sie sie in ein Futter mit frischem Gefriermedium, wobei Sie darauf achten, dass die Schneidfläche zur Mikrotomklinge zeigt. Setzen Sie dann eine frische feine Mikrotomklinge in den Kryostaten ein. Nachdem Sie die Form an der Klinge ausgerichtet haben, schneiden Sie den interessierenden Bereich mit einer empfohlenen Dicke von 20 bis 50 Mikrometern ab.
Stellen Sie sicher, dass die Markierungen im Inneren der Form auf den gefrorenen Block übertragen werden, um die Probe richtig auszurichten. Stellen Sie die Form während des Trimmens so ein, dass die Schnittfläche parallel zu den Referenzmarkierungen im Gefriermedium bleibt. Schneiden Sie Schnitte aus dem gefrorenen Block ab und sammeln Sie sie auf einem positiv geladenen Standard-Objektträger.
Überprüfen Sie die Schnitte unter einem Hellfeldmikroskop, um sicherzustellen, dass der Schnitt abgeschlossen ist. Nehmen Sie dann den Objektträger aus der Kryostatkammer und legen Sie ihn in ein vier Grad Celsius heißes Eisbad, während Sie ihn im Objektträgerhalter aufbewahren. Beginnen Sie mit der Kryosektion bei einer empfohlenen Dicke von 10 bis 14 Mikrometern.
Sammeln Sie Abschnitte auf positiv geladenen Objektträgern, bis der interessierende Bereich erreicht ist. Nehmen Sie nun den Einzelzell-Objektträger aus dem Eisbad und nehmen Sie den Objektträger aus der Halterung. Sammeln Sie die Abschnitte Reihe für Reihe mit einem feinen Pinsel, um ein Rollen zu verhindern.
Drücken Sie dann mit der Rückseite eines Pinsels eine Ecke des leeren Gefriermediums auf den Messertisch. Verwenden Sie die Oberseite der Rutsche als Drehpunkt und senken Sie die Rutsche langsam auf den Abschnitt, damit sie drei Sekunden lang haften kann, bevor Sie sie anheben. Reihen Sie serielle Abschnitte parallel zueinander, um den Platz auf der Folie zu maximieren.
Nachdem Sie Abschnitte aus dem interessierenden Bereich gesammelt haben, setzen Sie die Folie wieder in den Folienhalter ein. Wenn keine weiteren Proben benötigt werden, lagern Sie den Objektträger vor der Analyse bis zu zwei Wochen bei 80 Grad Celsius. Sammeln Sie Schnitte vor und nach dem interessierenden Bereich auf einem positiv geladenen Standardobjektträger und führen Sie Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen durch, um die Probenausrichtung und die Schnittqualität zu beurteilen, bevor Sie mit der Analyse fortfahren.
Die Ausrichtung mehrerer Abschnitte wurde durch den Vergleich von Strukturen zwischen Abschnitten im selben Schnitt überprüft. Anpassungen an den Einbettungs- und Entnahmeschritten ermöglichten es, eine größere Anzahl von Schnitten in den Bildgebungsbereich eines räumlichen Transkriptomobjektträgers einzufügen. Die räumliche transkriptomische Signalqualität war in Geweberegionen hoch, aber in leeren Objektträgerbereichen aufgrund der geringen Signalkomplexität geringer.
