Unsere Forschung nutzt das Zebrafischmodell, um menschliche Blutkrankheiten zu untersuchen, und konzentriert sich auf die Identifizierung neuartiger Biomarker, therapeutischer Ziele und Behandlungen für Erkrankungen wie Leukämie. Durch die Nutzung der einzigartigen Vorteile des Zebrafisches wollen wir die molekularen Mechanismen erforschen, die hämatologischen Erkrankungen zugrunde liegen, und innovative therapeutische Strategien entwickeln, um die Ergebnisse für Patienten zu verbessern. Die intravenöse Injektion in adulte Zebrafische ist aufgrund ihrer geringen Größe und ihres komplexen Gefäßsystems eine Herausforderung.
Wir haben eine optimierte IV-Injektionsmethode entwickelt, um Substanzen oder Zellen präzise und effizient in erwachsene Zebrafische zu verabreichen. Im Vergleich zur intrakardialen und retroorbitalen Injektion führte die hier vorgestellte IV-Methode zu einem besseren Überleben der Fische und einer besseren Zelltransplantation. Diese Methode macht adulte Zebrafische für nicht-termuale Studien besser nutzbar.
Die verbesserte IV-Technik überwindet einige Grenzen neuartiger Modelle und erhöht die Genauigkeit von Krankheitsmodellen und Wirkstoffscreenings und trägt so zur Weiterentwicklung neuer Therapien bei. Legen Sie zunächst den euthanasierten mpo:EGFP-transgenen Zebrafisch auf einen Präpariertisch. Präpariere den Zebrafisch, um das Nierenmark zu isolieren.
Übertragen Sie dann das Nierenmark in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Zellsuspensionsmedium. Pipettieren Sie die Suspension, um die Nierenmarkzellen zu disaggregieren. Filtrieren Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Nylon-Zellsieb.
Zentrifugieren Sie dann die Zellen acht Minuten lang bei 500 g und verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Zellsuspensionsmedium erneut suspendieren. Mit Hilfe eines automatisierten Zellzählers werden die Zellen mit einem 10 Mikroliter Aliquot gezählt. Waschen Sie die Hamilton-Spritze drei- bis viermal gründlich mit 75 % Ethanol.
Spülen Sie die Spritze dann drei- bis viermal mit Reinstwasser aus, um sicherzustellen, dass alle Ethanolrückstände entfernt werden. Nach der Verabreichung der Anästhesie an den Zebrafisch bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch verminderte Bewegung und Verlust der Reflexreaktionen. Positionieren Sie die Rückenseite des Fisches mit dem Kopf nach links auf sauberem, feuchtem Seidenpapier, um sie für die Injektion zu stabilisieren.
Fassen Sie die Hamilton-Spritze fest an und winkeln Sie die Nadel in einem Winkel von etwa 45 Grad zur Schwanzvene. Beim Casper-Zebrafisch zielen Sie auf einen sichtbaren Abschnitt des Gefäßes durch den durchscheinenden Körper. Führen Sie die Nadel vorsichtig in das Gefäß ein und verabreichen Sie zwei Mikroliter ganzer Nierenmarkzellen, die aus mpo:EGFP-transgenen Zebrafischen isoliert wurden.
Üben Sie nach der Injektion 10 Sekunden lang mit einem Wattestäbchen sanften Druck auf die Injektionsstelle aus, um die Blutung zu kontrollieren. Beobachten Sie den injizierten Zebrafisch unter einem Mikroskop, um die GFP-Signale im Gefäß zu bestätigen. Lassen Sie den injizierten Zebrafisch 10 Minuten lang in frisch sterilisiertem Fischwasser ruhen.
Setzen Sie den Fisch dann in ein statisches Aquarium um. Die intravenöse Injektionsmethode führte zu der höchsten Erfolgsrate, wobei bei 41 von 43 Fischen GFP-Signale sichtbar waren. Während bei der retroorbitalen Methode nur bei drei von 37 Fischen GFP nachgewiesen wurde, zeigte die intrakardiale Methode bei 11 von 40 Fischen Erfolg.
Die intravenöse Injektionsmethode führte zu besseren Überlebensraten bei injizierten Fischen, insbesondere bei höheren Zelldosen im Vergleich zu den retroorbitalen und intrakardialen Methoden. GFP-Signale wurden bereits am dritten Tag nach der Transplantation bei intravenös injizierten Fischen nachgewiesen, während retroorbitale und intrakardiale Methoden einen verzögerten Beginn des GFP-Signals zeigten. Am Tag 17 zeigten intravenös injizierte Fische die ausgeprägtesten GFP-Signale im Nierenmark.
Die Durchflusszytometrie des Nierenmarks zeigte etwa 18% GFP-positive Zellen in intravenös injizierten Fischen mit dreimal 10 hoch fünf Zellen, die mit den GFP-Spiegeln im Spendernierenmark übereinstimmten. Im Gegensatz dazu zeigten intrakardiale und retroorbitale Methoden 5%bzw. 2%GFP-positive Zellen.
