Wir versuchen, neue Arten von Chemie zu entdecken, um landwirtschaftliche Krankheitserreger zu bekämpfen. Mit der iChip-Technologie haben wir neuartige Organismen isoliert, von denen wir hoffen, dass sie zu neuen chemischen Erkenntnissen führen werden. Die Untersuchung dieser Organismen und/oder ihrer Naturstoffe gegen landwirtschaftliche Krankheitserreger führt möglicherweise zur Suche nach neuen Biopestizid-Kandidatenorganismen und/oder -verbindungen.
Die iChip-Methode ermöglicht es uns, Mikroorganismen zu isolieren, die unter herkömmlichen Bedingungen nicht kultivierbar sind, indem wir eine Zeit der Domestizierung und des Kontakts mit ihrer natürlichen Umgebung bereitstellen. Unser modifizierter iChip-Aufbau ist einfach, kostengünstig und reduziert das Risiko einer mikrobiellen Kontamination, so dass er für eine Vielzahl von Forschungszielen leicht zugänglich ist. Unsere iChip-Ergebnisse werfen Fragen auf, wie zum Beispiel: Welche Mechanismen treiben die Unterdrückung von Krankheitserregern durch neuartige Mikroben an?
Können diese bioaktiven Verbindungen in realen Studien zuverlässig funktionieren? Wie beeinflussen Umweltfaktoren ihre Wirksamkeit? Die Beantwortung dieser Fragen wird die nachhaltige Entwicklung von Biopestiziden leiten, das Management von Pflanzenkrankheiten verändern und die Abhängigkeit von synthetischen Fungiziden verringern.
Das Labor wird die iChip-Technologie anwenden, um neuartige Bakterien aus krankheitsunterdrückenden Böden zu isolieren, die durch Deckfruchtanbau entstehen, und so neuartige Mikroben und bioaktive Verbindungen zu identifizieren. Diese sollen in Studien zu kontrollierten Pflanzenkrankheiten getestet werden, um innovative, nachhaltige Alternativen zu synthetischen Fungiziden zur Bekämpfung landwirtschaftlicher Krankheiten zu entwickeln. Um einen modifizierten iChip mit einem 5-Millimeter-Agar-Stanzwerkzeug zu konstruieren, entfernen Sie die Böden der Wells von einer 96-Well-Platte.
Schneiden Sie 0,05 Mikrometer große Polycarbonat-Membranen in Rechtecke und stellen Sie sicher, dass die Abmessungen dem unteren Bereich einer 96-Well-Platte entsprechen. Tragen Sie einen Silikondichtstoff auf, um die Polycarbonatmembran auf den Boden der 96-Well-Platte zu kleben. Stellen Sie sicher, dass der Klebstoff die Vertiefungen abdichtet, aber die Öffnungen der Vertiefungen nicht vollständig bedeckt.
Lassen Sie die Platten 24 Stunden trocknen. Geben Sie 4,5 Milliliter steriles Wasser in jedes der 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit den Bezeichnungen A bis D und in jedes der 50-Milliliter-Röhrchen mit den Bezeichnungen E bis H.Geben Sie 1 Gramm Erde in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann 10 Milliliter Wasser in die Tube und wirbeln Sie die Mischung 10 Minuten lang.
Lassen Sie die Bodensuspension 10 Minuten lang absetzen. Anschließend 0,5 Milliliter des Bodenüberstands in das Röhrchen A pipettieren und gründlich mischen. Übertragen Sie nun 0,5 Milliliter der Zellsuspension von Röhrchen A in Röhrchen B und mischen Sie es gründlich.
Wiederholen Sie dies für alle verbleibenden Zentrifugenröhrchen und führen Sie eine Reihe von zehnfachen Verdünnungen über die acht Röhrchen durch. Tauchen Sie die iChips zunächst vollständig in 95 % Ethanol. Entfernen Sie nach 15 Minuten die Platten vom Ethanol und legen Sie sie auf ein steriles Papiertuch in die Laminar-Flow-Haube.
Lassen Sie das Ethanol verdampfen, während Sie den UV-Sterilisator in der Laminar-Flow-Haube 15 Minuten lang einschalten. Pipettieren Sie 360 Mikroliter steriles Succinat, minimale Salze oder SMS-Medien in die erste Säule der Platte, um als Kontrolle zu dienen. Geben Sie 45 Milliliter SMS in die Zellsuspension in der Tube E. Mischen Sie gründlich, um die Zellsuspension mit dem Agar zu kombinieren.
Pipettieren Sie 360 Mikroliter der Agarzellmischung in alle verbleibenden Vertiefungen der 96-Well-Platte. Sobald das Medium ausgehärtet ist, versiegeln Sie die Oberseite der Platte mit einer PCR-Plattenabdeckung. Füllen Sie die Platten mit den Röhrchen F, G und H, um insgesamt vier Platten mit zehnfachen Konzentrationsunterschieden herzustellen.
Legen Sie die Platten mit der Membranseite nach unten in einen Behälter mit ca. 1 Zoll Erde. Inkubieren Sie die Platten im Dunkeln des abgedeckten Behälters bei 25 Grad Celsius. Untersuchen Sie die iChips nach sechs Wochen auf mikrobielles Wachstum.
Spülen Sie den modifizierten iChip dreimal mit sterilem Wasser ab, um alle Schmutzpartikel zu entfernen. Wischen Sie die Oberseite und die Seiten der Platte mit 95%igem Ethanol ab und vermeiden Sie dabei die Seite mit der semipermeablen Membran. Schneide mit einer sterilen Klinge die Plattenabdeckung um eine Vertiefung mit einer Kolonie durch und entferne das Quadrat mit einer sterilen Pinzette.
Mit einem sterilen Streifenwerkzeug stechen Sie die Kolonie und streifen mit der Vier-Quadranten-Methode auf die SMS-Agarplatte. Inkubieren Sie die Platten eine Woche lang bei 25 Grad Celsius oder bis das Wachstum der Kolonie beobachtet wird. Untersuchen Sie nach der Inkubation die Kolonien, um die Isolierung der Kulturen zu bestätigen.
