Das Hauptziel dieses Verfahrens ist es, ein umfassendes Protokoll für die Kultivierung und Charakterisierung von Mikrophagen auf verschiedenen Implantatoberflächen und die Charakterisierung der Subtypen der Mikrophagen zu implementieren. Im Rahmen dieser Charakterisierung werden verschiedene Methoden eingesetzt, darunter qRT-PCR, EISA und CLSM, um die Genexpressionsprofile, sekretorischen Proteine und Zelloberflächenmarker zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen den Nutzen und die Wirksamkeit des implementierten Protokolls bei der Polarisierung von Mikrophagen und Implantatoberflächen und deren genauer Identifizierung anhand von Genexpression, sekretierten Proteinen und Zelloberflächenmarkern.
Darüber hinaus beschreiben die Marker revolt-konsistente und spezifische Expressionsmuster, die zur Unterscheidung verschiedener Subtypen von MDMs verwendet werden können. Insgesamt wird die Studie zur Entwicklung und zum Design von immunmodulatorischen Materialien beitragen, um erfolgreiche Geweberegenerationsprozesse zu verbessern und zu fördern, implantatassoziierte chronische Entzündungen zu verhindern und die erfolgreiche Implantatintegration zu verbessern. Zu Beginn werden die isolierten mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes in 15 Millilitern vorgewärmtem Monozyten-Bindungsmedium resuspendiert und in einen T-75-Zellkulturkolben überführt.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 90 Minuten, um die Adhäsion zu gewährleisten. Nach der Inkubation wird der Überstand entsorgt und die Zellen einmal mit einem vorgewärmten RPMI 1640 Medium gewaschen, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin und Streptomycin ergänzt wurde, indem der Kolben vorsichtig gekippt wird, um nicht anhaftende oder lose anhaftende Zellen zu entfernen. Geben Sie 15 Milliliter vollständiges Medium mit 10 Nanogramm pro Milliliter Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor zu den adhärenten Zellen.
Und inkubieren Sie sechs Tage lang, um die Differenzierung zu fördern. Nach der Differenzierung wird das Kulturmedium aus dem Kolben genommen und die Zellen fünf Minuten lang mit 10 Millilitern PBS gewaschen. Um die Adhärenzzellen zu lösen, fügen Sie 10 Milliliter vorgewärmte Zellablösungslösung hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang.
Klopfen Sie dann vorsichtig auf den Kolben, um die Zellen freizusetzen, und geben Sie sie in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Um die restlichen Zellen zu lösen, geben Sie 10 Milliliter PBS in den Kolben und verschrotten Sie die Zellen. Übertragen Sie die abgelösten Zellen in das 50-Milliliter-Röhrchen.
Die abgelöste Zellsuspension wird bei 300 g 10 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand wird verworfen, bevor die Zellen in fünf Millilitern vorgewärmtem vollständigem Medium resuspendiert werden. Zählen Sie die Zellen mit Hilfe der Trypanblau-Färbung auf einem Hämozytometer, um die Zellzahl und Lebensfähigkeit zu bestimmen. Bereiten Sie die Zellsuspension vor, indem Sie die Zellzahl auf 160.000 Zellen pro Milliliter des vollständigen Mediums einstellen.
Reinigen Sie anschließend die Biomaterial-Scheiben fünf Minuten lang mit Ultraschall in 70 % Ethanol, gefolgt von einer 30-minütigen Sterilisation in 70 % Ethanol. Legen Sie die Titanscheiben nach dem Trocknen in eine unbehandelte 24-Well-Platte und geben Sie jeweils einen Milliliter der vorbereiteten Zellsuspension in die Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um M0-Makrophagen zu erhalten.
Um M1-polarisierte Makrophagen zu erhalten, fügen Sie Interferon-Gamma und Lipopolysaccharid in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte hinzu. Für die M2-Polarisation fügen Sie Interleukin-4 und Interleukin-13 hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, um eine Polarisation zu induzieren.
Nach der Gewinnung polarisierter Monozyten-abgeleiteter Makrophagen aus mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes wird der Zellüberstand in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Übertragen Sie die Titanscheibe auf eine neue 24-Well-Platte. Zentrifugieren Sie den Zellüberstand bei 300 g fünf Minuten lang und überführen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen.
Messen Sie die Zytokine und Chemokine bei 450 Nanometern gemäß den spezifischen Anweisungen des Herstellers. Berechnen Sie die Konzentration der sezernierten Zytokine oder Chemokine anhand der Standardkurve. Messen Sie die Gesamtproteinmenge mit dem Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kit.
Normalisieren Sie die Konzentration der sekretierten Proteine auf Milligramm des Gesamtproteins. Waschen Sie die polarisierten Makrophagen zweimal in 800 Mikrolitern PBS. Inkubieren Sie die Scheiben in 400 Mikrolitern Fixierungspuffer für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
Nach dem Entfernen des Fixierpuffers die Scheiben dreimal in 400 Mikrolitern PBS waschen. Inkubieren Sie nun die Discs 30 Minuten lang mit 400 Mikrolitern Blockierungspuffer, um die unspezifischen Bindungsstellen zu blockieren. Entsorgen Sie den Blockierungspuffer und inkubieren Sie die Scheiben eine Stunde lang mit Primärantikörpern, die in 400 Mikrolitern Färbepuffer verdünnt sind.
Entfernen Sie nach einer Stunde die primären Antikörper und waschen Sie die Scheiben dreimal mit 400 Mikrolitern Waschpuffer. Für markierte Sekundärantikörper wird Fluor in Färbepuffer verdünnt zugegeben und eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Nach der Inkubation werden die Proben dreimal für jeweils drei Minuten im Waschpuffer gewaschen.
10 Millimolar DRAQ5 in PBS geben und 15 Minuten im Dunkeln inkubieren. Entfernen Sie dann den Überstand und waschen Sie die Scheiben einmal mit PBS. Fügen Sie einen Tropfen Eindeckmedium hinzu und setzen Sie nach fünf Minuten die Deckgläser auf und lassen Sie die Proben eine Stunde lang trocknen.
Nach dem Trocknen die Ränder mit klarem Nagellack versiegeln. Um einen Überblick über die Zellen zu erhalten, bilden Sie die Proben auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop unter 25-facher Vergrößerung ab. Ändern Sie die Vergrößerung auf 63X, um die Struktur und Lokalisierung von Oberflächenmarkierungen zu bestimmen.
Primäre Monozyten-abgeleitete Makrophagen wurden erfolgreich in M1- und M2-Makrophagen auf Titanoberflächen polarisiert, wobei CCR7 in M1-Makrophagen stärker und CD209 in M2-Makrophagen exprimiert wurde. Die qRT-PCR-Analyse zeigte eine erfolgreiche Polarisation von primären Monozyten-abgeleiteten Makrophagen sowohl auf Titan- als auch auf Deckglasoberflächen mit hoher Expression von CCR7 und TNF-alpha für M1 und CD209 und CCL13 für M2. Hohe Konzentrationen von inflammatorischem TNF-alpha-Zytokin und CCL13-Chemokin bestätigten die M1- und M2-Polarisation auf Proteinebene.
