Granulare Materialien wie MAP-Gerüste sind poröse injizierbare Materialien aus miteinander verbundenen Hydrogelpartikeln in Mikrogröße. Die Kontrolle der Partikelfraktion ist entscheidend für Materialeigenschaften und zelluläre Reaktionen. Variable Partikelfraktionen in MAP-Gerüsten führen zu einer Reihe von Gerüsteigenschaften und Zellantworten, aber diese Technik ermöglicht es Benutzern, die endgültige Partikelfraktion in den von ihnen erstellten MAP-Gerüsten zu definieren.
MAP-Gerüste können verwendet werden, um die Reparatur und Regeneration komplexer Wunden zu fördern sowie Medikamente zu verabreichen. Die Partikelfraktion beeinflusst beispielsweise die Geschwindigkeit und den Grad der zellulären Infiltration und Regeneration. Diese Methode kann in allen Klassen von körnigen Hydrogelen angewendet werden.
Jetzt, da wir MAP-Gerüste mit benutzergesteuerten Partikelfraktionen herstellen können, können wir die Bioaktivität dieser Materialien reproduzierbar untersuchen und einzigartige Zellreaktionen wie Einschluss untersuchen. Das Einrichten der mikrofluidischen Mikrogelerzeugung erfordert Zeit und Geduld, während Sie die Techniken erlernen. Es ist am besten, mehrere Geräte vorbereitet und bereit zu haben, falls Sie Probleme mit der Einrichtung haben.
Beginnen Sie mit der mikrofluidischen Produktion von Hyaluronsäure oder HA und Norbornen- oder NB-Mikrogelen. Wiegen Sie vor dem Trocknen der Mikrogele ein kryosicheres Schraubverschlussrohr. Anschließend in einer sterilen Haube die gewaschenen und gereinigten Mikrogele mit einer Verdrängerpipette in ein kryosicheres Schraubverschlussrohr geben.
Fügen Sie 70% Ethanol zu den gereinigten Mikrogelen hinzu und mischen Sie gut. Zentrifugieren Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 5.000 g. Saugen Sie den Überstand ab und fügen Sie 70% Ethanol hinzu.
Gut mischen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag kurz zentrifugieren, um sicherzustellen, dass sich die Mikrogele am Boden des Röhrchens befinden. Fügen Sie flüssigen Stickstoff in einen kryogenen Behälter und legen Sie die Tube mit Mikrogelen zum Einfrieren auf.
Nach fünf bis 10 Minuten die Tube mit Mikrogelen mit einer Pinzette entfernen. Entfernen Sie schnell die Kappe und bedecken Sie die Röhre mit Laborgewebe. Sichern Sie das Gewebe mit einem Gummiband und übertragen Sie es in einen Gefriertrocknungsbehälter oder eine Kammer.
Laden Sie die Probe gemäß den Anweisungen des Herstellers auf den Gefriertrockner und lyophilisieren Sie bei 0,066 Torr und minus 63 Grad Celsius. Wiegen Sie die lyophilisierten Mikrogele aus dem Röhrchen, bevor Sie sie bei Raumtemperatur lagern. Mischen Sie Polydimethylsiloxan oder PDMS-Elastomerbasis mit dem Härter im Massenverhältnis 10 zu eins.
Gießen Sie die PDMS-Mischung in eine große Kunststoff-Petrischale und entgasen Sie 30 Minuten lang im Exsikkator oder bis alle Blasen verschwunden sind. Sobald alle Blasen verschwunden sind, platzieren Sie die 3D-gedruckte Form vorsichtig in das PDMS, um die Bildung neuer Blasen zu minimieren. Für zwei Stunden bei 60 Grad Celsius in den Ofen stellen, um das PDMS auszuhärten.
Verwenden Sie nach dem Aushärten ein Messer oder eine Rasierklinge, um den Umfang des Kulturgeräts vorsichtig zu umkreisen, und entfernen Sie die Form vorsichtig. Verwenden Sie einen Vier-Millimeter-Biopsiestempel, um PDMS vom Boden der Vertiefungen zu entfernen. Schneiden Sie die Geräte so ab, dass sie auf einen Glasdeckel passen.
Verwenden Sie Klebeband, um Staub von der Unterseite des Kulturgeräts zu entfernen. Stellen Sie den sauberen Glasdeckel und das Kulturgerät für 15 Minuten auf eine Heizplatte bei 135 Grad Celsius, um Feuchtigkeit zu entfernen. Verwenden Sie in einem Abzug eine Corona-Plasmapistole hoch auf dem Glasdeckel und der Unterseite des Geräts für 30 Sekunden.
Dann verkleben Sie die behandelten Oberflächen schnell miteinander. Üben Sie vorsichtig Druck aus, um eine gute Abdichtung zwischen dem Kulturgerät und dem Glasdeckel zu gewährleisten. Stellen Sie das Gerät über Nacht in einen 60-Grad-Ofen, um die Verbindung zu sichern.
Am nächsten Tag autoklavieren Sie das Gerät, um es vor der Verwendung in vitro zu sterilisieren. Als nächstes bereiten Sie die mikroporösen geglühten Partikel oder MAP-Gerüstkomponenten basierend auf der gewünschten Partikelfraktion für die Zellkultur in MAP-Gerüsten vor. Wiegen Sie lyophilisierte Mikrogele, um die Masse der Mikrogele zu bestimmen.
Dann rekonstituieren Sie die Mikrogele in 84% des endgültigen MAP-Volumens der Zellmedien basierend auf dem gewählten Gewichtsprozent MAP. Lassen Sie die Mikrogele 20 Minuten aufquellen. Die Hyaluronsäure oder HA-Tetrazin und die Zellmedien werden in 16% des endgültigen MAP-Volumens gelöst.
Sobald die Zellen den gewünschten Zusammenfluss erreicht haben, heben und zählen Sie die Zellen. Übertragen Sie 10.000 Zellen pro Mikroliter MAP in eine neue Röhre. Zentrifugieren Sie die Zellen und saugen Sie den Überstand aus dem Pellet ab, ohne die Zellen anzusaugen.
Mikrogele und Vernetzer mit einer Verdrängerpipette zum Pellet geben. Gut mischen und 10 Mikroliter pro Vertiefung säen. Pipette in kreisenden Bewegungen, um die Mischung gleichmäßig im Vertiefung zu verteilen.
Lassen Sie die Mikrogele 25 Minuten bei 37 Grad Celsius glühen, bevor Sie Zellmedien hinzufügen, um die Vertiefungen zu füllen. Halten Sie die 3D-Kulturen bei 37 Grad Celsius und wechseln Sie die Medien nach Bedarf. Um ein Ansaugen des Gerüsts zu vermeiden, stabilisieren Sie die Pipettenspitze entlang des Kamms der oberen Vertiefung.
Zu den gewünschten Zeitpunkten fixieren Sie Proben, indem Sie die Medien 30 Minuten lang bei Raumtemperatur durch 50 Mikroliter 4% Paraformaldehyd pro Vertiefung ersetzen. Waschen Sie die Proben dreimal mit 50 Mikrolitern PBS oder bevorzugtem Puffer und fahren Sie mit der Immunfluoreszenz oder Fluoreszenzfärbung unter Verwendung von 50 Mikrolitern pro Vertiefung sowie dem Arbeitsvolumen fort. Es wurde gezeigt, dass mikrofluidische Geräte mit einem strömungsfokussierenden Bereich HA-NB-Mikrogele mit einem Durchmesser von entweder 50 oder 100 Mikrometern erzeugen.
Das Medium zur Lyophilisierung der Mikrogele wurde optimiert, um die Kryogelbildung durch die Verwendung von 70% Ethanol zu minimieren. Andere Medien wie Isopropylalkohol, Wasser und Acetonitril können jedoch austauschbar verwendet werden, um die Bildung von Kryogel zu erleichtern. Um die bioorthogonale Vernetzung von HA-NB-Mikrogelen zu erleichtern, wurde ein linearer HA-Tetrazin-Vernetzer synthetisiert.
Die Protonen-NMR-Spektroskopie zeigt eine erfolgreiche Modifikation von 11% der HA-Wiederholungseinheiten mit einer Tetrazin-Pendant-Gruppe. Das getrocknete lyophilisierte Mikrogelprodukt wurde mit speziellen Volumina rehydriert und geglüht, um unterschiedliche Gewichtsprozentformulierungen von Mikrogelen in MAP-Gerüsten zu erhalten. Diese Gewichtsprozentsätze von Mikrogelen in MAP-Gerüsten entsprachen eindeutigen Partikelfraktionen.
Zellkultur in MAP-Gerüsten wird hier gezeigt. Zellen in 3D-Kultur in MAP-Gerüsten wurden am fünften Tag fixiert, gefärbt und mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Einzelne Z-Schnitte zeigen Unterschiede im Zellwachstum und Gerüste mit unterschiedlichen Gewichtsprozenten MAP.
Wählen Sie Ihre Lyophilisationsmedien entsprechend aus, je nachdem, ob Sie Kryogele wünschen oder nicht. Überspringen Sie keine Inkubationsschritte, damit Ihre Mikrogele genügend Zeit haben, in den Medien aufzuquellen. Standardtechniken wie Mikroskopie, Durchflusszytometrie, RNA-Sequenzierung und mehr können verwendet werden, um Zellantworten in diesen körnigen Materialien mit definierten Porositäten zu bewerten.
