Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, die Bindungsaffinitäten von Aptameren gegen lösungsfreie Ziele zu bestimmen und gleichzeitig Einblicke in den Bindungsmechanismus zu geben. Da ITC Wärmeänderungen aufgrund von Bindung misst, müssen weder Aptamer noch Ligand markiert oder funktionalisiert werden, wie dies bei Techniken wie SPR der Fall wäre. Neue Benutzer sollten genau darauf achten, Puffer über alle Bindungskomponenten hinweg abzugleichen.
Beachten Sie außerdem, dass die Technik hohe Probenanforderungen hat, die für größere Liganden wie Proteine schwer zu erfüllen sein können. Um zu beginnen, aktivieren Sie die Membran der Dialysensäule, füllen Sie mit PBS-Puffer, baquilibrieren Sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie bei 5.000 mal G für 15 Minuten. Entfernen Sie den Puffer und laden Sie 500 Mikroliter Aptamerproben in die Säule.
Zentrifugieren Sie bei 5.000 mal G und wiederholen Sie es viermal, um den ursprünglichen Puffer gegen PBS auszutauschen. Sammeln Sie das dialysierte DNA-Aptamer mit einer Pipette und überführen Sie es in das neue 1,5-Milliliter-Röhrchen. Sammeln Sie den letzten Durchflusspuffer, um Tetracyclin aufzulösen.
Stellen Sie sicher, dass der Puffer für den Experiment in der Spritze mit dem Puffer in der Referenzzelle übereinstimmt. Bestimmen Sie die Aptamerkonzentration erneut mit einem UV-sichtbaren Spektrometer. Verwenden Sie den letzten Austauschpuffer, um die Konzentration auf 40-Mikromol-Tetracyclin und zweimikromolares Aptamer einzustellen.
Falten Sie das DNA-Aptamer, indem Sie es 10 Minuten lang bei 90 Grad Celsius erhitzen, 10 Minuten bei vier Grad Celsius abkühlen und dann für 20 Minuten auf Raumtemperatur zurückkehren. Entgasen Sie das gefaltete Aptamer und dialysierte Tetracyclin mit einer Entgasungsstation oder Vakuumpumpe für 25 Minuten, um gelöste Gase zu entfernen. Nachdem Sie die Sauberkeit der Maschine gereinigt und bestätigt haben, testen Sie die Genauigkeit der Maschine mit einem Standardkit, das EDTA und Calciumchlorid enthält, mit dem Standardprogramm und gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Richten Sie die Ausführungsparameter ein. Überprüfen Sie die benötigten Volumes mit einem laufenden Programmrechner. Mit diesem Laufparameter führen Sie eine ITC-Messung mit 230 Mikrolitern 40-Mikromol-Tetracyclin in der ITC-Spritze und 485 Mikrolitern zweimikromolaren Aptamer in der ITC-Probenzelle unter Verwendung der ITC durch.
Laden Sie die dialysierten Tetracyclin-Spritzenplatten und das gefaltete Aptamer mit einer Pipette unter Vermeidung von Blasen in die Probenzelle. Starten Sie den Betrieb des ITC-Instruments, indem Sie in der Software auf die Schaltfläche Start klicken. Öffnen Sie die Datenanalysesoftware durch Doppelklick, um mit der Analyse der Daten zu beginnen.
Öffnen Sie den Pfad der gespeicherten Rohdaten, um die Tendenz der Bindung zu erfahren. Öffnen Sie die Registerkarte Modellierung, und verwenden Sie verschiedene Bindungsmodelle, um die beste Anpassung für die Datenkurve zu finden. Dann berechnet die Software automatisch das ITC-Thermogramm und verschiedene thermodynamische Parameter, einschließlich Enthalpie, Entropie, freie Energie, Gleichgewichtsbindungskonstante und Stöchiometrie.
Sammeln Sie die thermodynamischen Parameter, die aus den Daten und Anpassungsmodellinformationen ermittelt werden. Erstellen Sie einen Bericht mit Bildern des ITC-Thermogramms und verschiedener thermodynamischer Parameter. Das von Kim et al. ausgewählte Aptamer bindet an Tetracyclin mit Bindungsaffinitäten der Dissoziationskonstante eins entspricht 13 Mikromolar und Dissoziationskonstante zwei entspricht 53 Nanomolaren.
Das Anpassungsmodell und die Stöchiometrie von ITC zeigen, dass das Aptamer über ein Bindungsverhältnis von 2:1 an Tetracyclin mit dem sequentiellen Bindungsmodell bindet. Die thermodynamischen Parameter, die durch ITC-Messungen für Standort zwei bestimmt wurden, zeigten, dass die Enthalpie, die relativ signifikante entropische Verluste überwindet, die starke Bindung antreibt. Die enthalpiegetriebene Bindung mit Entropieverlust bezieht sich auf Nukleinsäurekonformationsänderungen, die als Bindungsverhalten zwischen RNA und einem kleinen Molekül berichtet wurden.
Aptamer und Ligand müssen sich im selben Puffer befinden. Das Aptamer sollte wieder gefaltet werden, wenn es mit Refolding entwickelt wurde, und die Proben müssen entgast werden. Durch die Berücksichtigung dieser Überlegungen wird sichergestellt, dass nur Aptamer-Ligand-Wechselwirkungen zum gemessenen Signal beitragen.
Aufgrund der Größe des Aptamer-Targets könnte eine geeignete Folgemethode die mikroskalige Thermophorese sein, um die gemessene Bindungsaffinität frei in Lösung zu bestätigen.
