Die Anwendung von Lucifer Yellow auf die Medien von Apical-out-Enteroiden bietet eine einfache Methode zur quantitativen und qualitativen Analyse aller drei wichtigsten parazellulären intestinalen Permeabilitätswege in einem 3D-Modell. Es ist eine relativ einfache Technik, die es uns ermöglicht, die Permeabilität mit einem enteroiden Modell zu beurteilen. Wir arbeiten mit dieser Technik in unseren Studien der nekrotisierenden Enterokolitis.
Diese Technik kann jedoch bei der Untersuchung jeder menschlichen Darmerkrankung unter Verwendung eines enteroiden Modells nützlich sein. Die Verfahren werden heute von unseren Postdoktoranden Dr. Tyler Leiva und Dr. Alena Golubkova sowie Camille Schlegel, der wissenschaftlichen Betreuerin aus unserem Labor, demonstriert. Um zu beginnen, wachsen Sie die in BMM eingebetteten Androiden für sieben bis 10 Tage mit 50% LWRN-konditionierten Medien für die apikale Out- oder AO-enteroide Generation.
Entfernen Sie die Medien aus der Umgebung der BMM-Kuppeln und fügen Sie 500 Mikroliter Zellwiederherstellungslösung oder CRS in eine Vertiefung hinzu. Schaben Sie die Kuppel ab, pipetten Sie sie mehrmals auf und ab, um das CRS mit den in BMM-Schnappscheiben eingebetteten Enteroiden zu homogenisieren, und fügen Sie diese Lösung der nächsten Vertiefung hinzu. Schaben Sie die Kuppel erneut ab und pipetten Sie sie mehrmals auf und ab, bevor Sie die Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben.
Fügen Sie 500 Mikroliter CRS in die zweite Vertiefung hinzu, pipettieren Sie es auf und ab, um es gut zu mischen und in die erste Vertiefung zu überführen. Von der ersten Vertiefung aus die enteroide CRS-BMM-Lösung in dasselbe 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen poolen und dieses Pooling für die verbleibenden Bohrlöcher wiederholen, bis der Inhalt aller Bohrlöcher in CRS ist. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit gepoolter CRS-Lösung für eine Stunde bei vier Grad Celsius auf einen Rotator.
Dann zentrifugieren Sie das Mikrozentrifugenröhrchen bei 200 X g für drei Minuten bei vier Grad Celsius, bevor Sie den Überstand entfernen und das enteroide Pellet in einem Milliliter 50% LWRN konditioniertem Medium wieder suspendieren. Übertragen Sie vorsichtig 500 Mikroliter der resuspendierten enteroiden oder Medienlösung in jede Vertiefung der ultra-low attachment 24 well Gewebekulturplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 für drei Tage vor dem Experiment.
Stellen Sie sicher, dass AO-Enteroide vor der Anwendung mindestens 72 Stunden lang ausgesetzt sind. Übertragen Sie vorsichtig alle in Medien suspendierten Enteroide aus jeder Vertiefung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Bei 300 X g drei Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand entfernen.
Fügen Sie 10 Mikroliter von fünf Milligramm pro Milliliter Lipopolysaccharid oder LPS zu 500 Mikrolitern 50% LWRN konditioniertem Medium pro Vertiefung hinzu, um die Mastermischung vorzubereiten, und suspendieren Sie das AO-Enteroidpellet aus der Behandlungsgruppe in 500 Mikroliter LPS plus 50% LWRN konditioniertes Medium. Pipetten Sie nach oben und unten, um gründlich zu mischen. Aliquot 500 Mikroliter Suspension in jede Vertiefung einer 24 Wells Ultra Low Attachment Platte.
In ähnlicher Weise werden die AO-Enteroide aus der unbehandelten Kontrollgruppe in 500 Mikroliter 50% LWRN-konditioniertes Medium pro Vertiefung und aliquot 500 Mikroliter dieser Suspension in jede Vertiefung einer separaten 24-Well-Ultra-Low-Befestigungsplatte resuspendiert. Induzieren Sie eine Hypoxie in den LPS-behandelten AO-Enteroiden mit einer modularen Inkubatorkammer mit 1% Sauerstoff, 5% Kohlendioxid und 94% Stickstoff und inkubieren Sie die Enteroide mit Hypoxie und LPS für 24 Stunden. Legen Sie die unbehandelten und LPS plus Hypoxie, behandelte Kulturen für 24 Stunden in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator.
Um die parazelluläre Permeabilität mit Lucifer Yellow oder LY zu messen, geben Sie die enteroide oder Mediensuspension aus jeder Vertiefung vorsichtig in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Warme phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder DPBS von Dulbecco und 50% LWRN konditionierte Medien in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 300 X g für drei Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie das Medium und waschen Sie das enteroide Pellet mit 500 Mikrolitern warmem DPBS vor der Zentrifugation bei 300 X g für drei Minuten. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette und wiederholen Sie den DPBS-Waschschritt noch einmal. Nachdem der DPBS gewaschen wurde, fügen Sie 450 Mikroliter warme 50% LWRN konditionierte Medien hinzu und fügen Sie die Suspension zu einer 24-Well-Platte hinzu.
Dann fügen Sie 50 Mikroliter von 2,5 Milligramm pro Milliliter LY zu jeder Vertiefung hinzu. Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um zu mischen, und legen Sie sie für zwei Stunden in einen 5% Kohlendioxid-Inkubator. Pipettieren Sie die enteroide Suspension vorsichtig aus jeder Vertiefung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
Zentrifugieren Sie es und entfernen Sie den Überstand, wobei das enteroide Pellet zurückbleibt. Waschen Sie das Pellet mit 500 Mikrolitern warmem DPBS und zentrifugieren Sie es. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet zurück.
Wiederholen Sie drei Wäschen des DPBS, bevor Sie das Pellet mit 1000 Mikrolitern kaltem DPBS erneut suspendieren, und dissoziieren Sie die Enteroide durch kräftiges Mischen mit einer Pipette. Für die Lucifer-Gelb-Standardkurve bereiten Sie die in DPBS verdünnten Standards wie im Text beschrieben vor. Pipettieren Sie 150 Mikroliter jeder Probe pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung auf einer 96-Well-Platte.
Messen Sie die Fluoreszenz bei einem Anregungspeak von 428 Nanometern und einem Emissionspeak von 536 Nanometern auf einem Fluoreszenzplattenleser. Berechnen Sie die Konzentrationen mit Hilfe einer statistischen Software und einer Vier-Parameter-Kurve, die die Standardkurve interpoliert. Die Immunfluoreszenzfärbung der Enteroide, die 72 Stunden lang in 50% LWRN-Medien suspendiert waren, zeigte Zo-1 auf der äußeren apikalen Oberfläche des Enteroids, während Beta-Catenin auf der basolateralen Oberfläche zu sehen ist.
Es zeigte die erwartete Polaritätsumkehr von Enteroiden an, die eine AO-Konformation von Enteroiden bestätigten. Basolaterale Out- oder BO-Enteroide, die mit LPS und Hypoxie behandelt wurden, zeigten eine signifikant erhöhte Permeabilität, was in einem Lucifer Yellow- oder LY-Assay durch die erhöhte Aufnahme von LY-Farbstoff in das enteroide Lumen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen nachgewiesen wurde. Der Lucifer Yellow-Test zeigte auch die erhöhte Aufnahme von LY im Lumen von behandelten AO-Enteroiden im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen.
Es bestätigte die erhöhte Permeabilität von AO-Enteroiden, die mit LPS und Hypoxie behandelt wurden, im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen. Es ist wichtig, die enteroiden Pellets gründlich zu waschen, um sicherzustellen, dass alle extraluminalen LY entfernt werden. Es ermöglicht die genaue Quantifizierung des verbleibenden intraluminalen LY bei der Berechnung der Permeabilität.
Für die qualitative Analyse können Enteroide mittels Fluoreszenzmikroskopie zur LY-Aufnahme in das Lumen sichtbar gemacht werden. Nach der LY-Inkubation und den anschließenden Waschschritten vor der Dissoziation vom Microplatten-Lesen.
