Organoid-abgeleitete Monoschichten rekapitulieren die intestinale Epithelbarrierefunktion des Patienten und ermöglichen es, die Wirkung von Therapien zu testen, die darauf abzielen, die Dysfunktion bei jedem Patienten zu verbessern, um personalisierte Behandlungsstrategien zu identifizieren. Organoid-Monoschichten bieten Zugang zur apikalen Seite des Epithels, der Seite, auf der der Schaden auftritt, und es ist normal und zugänglich in Organoiden, die als 3D-Strukturen wachsen. Jedes Organoid ist anders, daher der Kampf.
Um enge Monoschichten zu bilden, verwenden Sie Organoide in der Proliferationsphase und verdauen Sie schnell, um Cluster von zwei bis vier Zellen zu bilden. Titrieren Sie die Zellaussaat für jedes Modell. Die Demonstration des Verfahrens wird von Wies Van Dooremalen, einem leitenden wissenschaftlichen Mitarbeiter von HUB, durchgeführt.
Beginnen Sie mit der Beschichtung von Membraneinsätzen mit extrazellulärer Matrix oder ECM. Arbeiten Sie in einer Biosicherheitswerkbank und legen Sie die Membraneinsätze in die Trägerplatte. Verdünnen Sie das ECM 40X in eiskalten DPBS mit Kalzium und Magnesium und pipettieren Sie dann 150 Mikroliter des verdünnten ECM in das apikale Kompartiment jedes Einsatzes.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für mindestens eine Stunde. Um die Zellen für die Aussaat vorzubereiten, wärmen Sie ein Aliquot Zelldissoziationsreagenz in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad vor. Verwenden Sie zwei Milliliter des Reagenzes für jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen.
Übertragen Sie die Kulturplatte mit den Organoiden aus dem Inkubator in die Biosicherheitskabine. Verarbeiten Sie die Organoide wie im Textmanuskript beschrieben, aber fassen Sie nicht mehrere Röhren in einer Röhre zusammen. Nach der Ernte der Organoide fügen Sie Basalmedium oder BM zu 12 Millilitern hinzu und zentrifugieren Sie bei 85 mal G, dann aspirieren Sie den Überstand.
Füllen Sie das Röhrchen mit den Organoiden mit bis zu 12 Millilitern DPBS und pipettieren Sie dann 10 Mal mit einer 10-Milliliter-Pipette auf und ab. Zentrifugieren Sie bei 85 mal G für fünf Minuten bei acht Grad Celsius und saugen Sie den Überstand ab, ohne das Organoidpellet zu stören. Fügen Sie das vorerwärmte Zelldissoziationsreagenz zu den Organoiden hinzu und suspendieren Sie sie, dann inkubieren Sie die Röhrchen diagonal oder horizontal für fünf Minuten im Wasserbad bei 37 Grad Celsius.
Nach der Inkubation 10 Mal mit einer sterilen Fünf-Milliliter-Kunststoffpipette oder einer P1000-Pipette auf und ab pipettieren. Überprüfen Sie die Organoidsuspension unter dem Mikroskop, um zu sehen, ob sich eine Mischung aus Einzelzellen und einigen Zellklumpen, bestehend aus zwei bis vier Zellen, gebildet hat. Stoppen Sie die Zelldissoziation, indem Sie bis zu 12 Milliliter BM mit ROCK-Inhibitor zur Zellsuspension hinzufügen.
Zentrifugieren Sie die Zellen und saugen Sie dann den Überstand ab, ohne das Zellpellet zu stören. Wenn Sie die gleiche Organoidkultur in mehreren Röhrchen handhaben, sammeln Sie die Zellpellets, bevor Sie sie in 12 Millilitern BM resuspendieren. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Sieb, das mit BM vorbenetzt ist, und ernten Sie den Durchfluss in ein konisches 50-Milliliter-Rohr, waschen Sie das Sieb dann mit 10 Millilitern BM und ernten Sie den Durchfluss in dasselbe Rohr. Die gespannte Zellsuspension in zwei neue 15 Milliliter konische Röhrchen überführen und die Zentrifugation wiederholen.
Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen in vier Millilitern IEM, ergänzt mit 10 Mikromolar ROCK-Inhibitor pro voller Kulturplatte, die als Ausgangsmaterial verwendet wird. Mischen Sie eine kleine Menge Zellsuspension in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis mit Trypan Blue zum Zählen, dann zählen Sie die Zellen und berechnen Sie die Gesamtzahl der lebenden Zellen, wobei Sie jede einzelne Zelle in kleinen Klumpen zählen. Bereiten Sie eine Zellsuspension vor, die 3X 10 bis die sechsten lebenden Zellen pro Milliliter IEM enthält, ergänzt mit 10 mikromolaren ROCK-Inhibitoren.
Um die Zellen zu säen, saugen Sie DPBS vorsichtig aus den ECM-beschichteten Einsätzen ab und halten Sie die Platte horizontal. Pipette 800 Mikroliter IEM ergänzt mit ROCK-Inhibitor in jedes basolaterale Kompartiment und 150 Mikroliter der Zellsuspension, die auf die ECM-beschichtete Membran im apikalen Kompartiment dropwise vorbereitet wird. Legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in den Inkubator.
Sobald die Zellen auf der Membran sedimentiert sind, messen Sie jeden Tag den transepithelialen elektrischen Widerstand oder TEER und bilden Sie die Membraneinsätze mit einem Mikroskop ab. Um die Monoschichten aufzufrischen, entfernen Sie das Medium aus den basolateralen Kompartimenten der Platte, die die Membraneinsätze enthält, und saugen Sie das Medium vorsichtig aus den apikalen Fächern ab. Fügen Sie 150 Mikroliter frisches IEM tropfenweise zu jedem apikalen Fach hinzu und fügen Sie 800 Mikroliter frisches IEM zu jedem basolateralen Fach hinzu.
Wenn Sie ein manuelles TEER-Messgerät verwenden, reinigen Sie die Elektrode mit 70% Ethanol und lassen Sie sie in der Biosicherheitskabine an der Luft trocknen, und legen Sie die Elektrode dann in ein Rohr, das BM enthält. Schließen Sie die Elektrode an das manuelle TEER-Messgerät an und schalten Sie den Funktionsschalter ein, um in Ohm zu messen und den Netzschalter einzuschalten. Legen Sie die kurze Elektrode in das apikale Fach des Einsatzes und die lange Elektrode in das basolaterale Fach, ohne die Monoschicht zu berühren. Messen Sie den Widerstand im Rohlingsbrunnen und dann in den verbleibenden Proben.
Waschen Sie die Elektrode mit BM zwischen Proben mit unterschiedlichen Bedingungen. Wenn Sie fertig sind, reinigen Sie die Elektrode mit Demi-Wasser und mit 70% Ethanol und lassen Sie sie dann an der Luft trocknen. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Darmorganoide zu ernten und Monoschichten von Epithelzellen herzustellen.
Eine Monolayer, die acht Tage lang in IEM kultiviert wurde, ist hier zu sehen. Eine Struktur kann beobachtet werden, wenn Monoschichten einem Enterozytendifferenzierungsmedium oder EDM ausgesetzt werden, während Monoschichten, die einem Kombinationsmedium oder CDM ausgesetzt sind, eine glattere Struktur aufweisen. Auf die Monolayer-Bildung folgte quantitativ die Messung des TEER.
Eine vollständig konfluierende Monoschicht hatte einen TEER-Wert von etwa 100 Ohm Zentimeter im Quadrat, der zunahm, wenn er einem der beiden Differenzierungsmedien ausgesetzt wurde. Monoschichten zeigten unter allen mittleren Bedingungen eine geringere scheinbare Durchlässigkeit für Luzifergelb. Die Lysozymsekretion durch in IEM kultivierte ileale Monoschichten war höher als die von Monolayern, die in IEM kultiviert wurden, bis zum Zusammenfließen und für weitere vier Tage in EDM oder CDM.
Monolayer, die in IEM, IEM und nachfolgendem EDM oder IEM und nachfolgendem CDM kultiviert werden, zeigen Unterschiede in der Morphologie, die bei H & E-, Ki67-, MUC2- und Alcian Blue-Färbungen beobachtet wurden. Bei der Differenzierung nahmen die proliferativen Zellen ab, während die Genexpression von Becherzellen und Enterozytenmarkern im Vergleich zu der unter IEM-Bedingungen beobachteten Expression zunahm, wie LGR5, MUC2 und alkalische Phosphatase-Genexpression zeigen. Bei der Herstellung von Monoschichten ist es wichtig, Anoikis in den Organoiden nach der Verdauung zu verhindern.
Zusätzlich sollte ECM in Zellen gleichmäßig auf den Transwell-Membranen verteilt sein. Organoid-abgeleitete Monoschichten erlauben die patientenspezifische Auswertung von Molekültransporten mit unterschiedlichen fluoreszierenden Substraten.
