spielen eine Schlüsselrolle bei der Initiierung und Durchführung mittels molekularer Modellierung. Wir untersuchen den Effekt von Posttranslationsmodifikationen und Mutationen auf die Caspase-Struktur und -Funktion. Wir beschreiben den molekulardynamischen Ansatz, der einen Blick auf die Evolution des Proteins nach der Einführung struktureller Modifikationen auf atomarer Ebene gibt.
Ein solcher Ansatz ist von besonderer Bedeutung, um die Mechanismen zu verstehen, die den Zelltod und damit verbundene Störungen regulieren, und um neue wirksame Therapien zu entwickeln. Wir demonstrieren molekulare Modellierungsfähigkeiten mit einem der beliebtesten Tools, Amber 20. Das vorgestellte Protokoll kann aber auch mit den formalen Versionen dieser Software verwendet werden.
Das folgende Video beschreibt Schritt für Schritt eine Anleitung zur Vorbereitung der Caspase-Struktur für die Simulation und zur Durchführung einer Ascilica-Untersuchung dieses Protein-Wildtyps und modifizierter Formen. Um die ausgewählte Proteindatenbank oder PD B Struktur abzurufen, verwenden Sie die Dropdown-Liste der Download-Dateien und klicken Sie auf das P D B Format. Entfernen Sie Bemerkungen und Verbindungsdaten und legen Sie eine T E R-Karte zwischen separaten Proteinketten in die PD B Datei ein.
Um das Startmodell vorzubereiten, starten Sie das T-LEAP-Programm aus dem Amber Tools-Paket. Laden Sie dann das Kraftfeld F F 14 S B, um das Protein mit molekularer Mechanik und die Parameter für Wassermoleküle und Atomionen wie Natrium und Chlorid zu beschreiben, indem Sie die angegebenen Befehle in die Befehlszeile eingeben. Laden Sie als Nächstes die PD B-Datei und erstellen Sie Koordinaten für Wasserstoff, wodurch ein Objekt namens mol entsteht.
Überprüfen Sie mit dem Befehl check mol auf interne Inkonsistenzen, die Probleme verursachen könnten. Erstellen Sie eine Lösungsmittelbox um das Protein. Überprüfen Sie dann die Gesamtladung, indem Sie die Ladung mol eingeben und Gegenionen hinzufügen, um das System zu neutralisieren.
Erstellen Sie die Top-Datei für die Topologie P R M und die Koordinatendatei I N P C R D, indem Sie den angegebenen Befehl eingeben. Wenn Sie fertig sind, beenden Sie das T-lEAP-Programm. Führen Sie die erste Stufe der Energieminimierung durch, um die Positionen der hinzugefügten Wasserstoffatome und Wassermoleküle zu optimieren, während die Proteinkoordinaten durch Positionsbeschränkungen für schwere Atome fixiert bleiben.
Führen Sie das Programm P M E M D aus, indem Sie den angegebenen Befehl eingeben. Befolgen Sie die erforderlichen Argumente, während ich Daten kontrolliere. P molekulare Topologie, Kraftfeldparameter und Atomnamen.
C Anfangskoordinaten. O vom Benutzer lesbare Log-Ausgabe R Endkoordinaten. REF, Referenzkoordinaten für Positionsbeschränkungen.
Als nächstes führen Sie die zweite Stufe der Energieminimierung ohne Einschränkungen durch, um das gesamte System mit den Eingaben des angegebenen Befehls zu optimieren. Diese Stufe zielt darauf ab, das System von null auf 300 Kelvin zu erhitzen. Führen Sie den Erwärmungsprozess mit Positionsbeschränkungen an den Proteinatomen mit 50 Pikosekunden bei konstanter Lautstärke durch, indem Sie den angegebenen Befehl als Eingabe verwenden.
Folgen Sie dem erforderlichen Argument, da X-Koordinatensätze über die Trajektorie der Molekulardynamik gespeichert werden. Die nächste Stufe ist notwendig, um die Dichte des Wassers einzustellen und den Gleichgewichtszustand des Proteins zu erhalten. Führen Sie den Ausgleich bei 300 Kelvin für 500 Pikosekunden bei konstantem Druck ohne Einschränkungen mit dem angegebenen Befehl durch, nachdem das Gleichgewicht erfolgreich erreicht wurde.
Führen Sie eine Produktionsmolekulardynamiksimulation für 10 Nanosekunden oder länger bei konstantem Druck durch und generieren Sie die Trajektoriendatei für die anschließende Analyse der Proteinstruktur mit dem angegebenen Befehl. Die parallele Version des Programms, P M E M D M P I oder G P U beschleunigte Version P M E M D cuda kann auf Computerclustern und Supercomputern verwendet werden. Eine lange Molekulardynamiksimulation kann in mehrere Segmente zerlegt und nacheinander durchgeführt werden.
In dieser Analyse wurden der Wildtyp Caspase two und seine Serin-384-Alaninmutante nach dem Workflow der Molekulardynamikmodellierung untersucht. Die Serin-384-Alaninsubstitution induzierte eine wichtige Konformationsänderung im aktiven Zentrumsrest Arginin-378. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Serin-384-Alaninsubstitution die Substraterkennung durch die Argininreste im aktiven Zentrum beeinflusste und die Gießbasenaktivität beeinträchtigte.
Die vor Ort gerichtete Mutagenese und biochemische Tests zeigten, dass die Serin-384-Alanin-Mutation die enzymatische Aktivität bei der Verarbeitung von Caspase zwei blockierte und die Apoptose von Krebszellen unterdrückte. Der beschriebene Ansatz kann verwendet werden, um die Wirkung von Aminosäuremutationen und posttranslationalen Modifikationen in Caspase zwei sowie anderen Caspase, die an verschiedenen Krebserkrankungen beteiligt sind, zu bewerten.
