Die Darmbakterien können mehrere physiologische Prozesse von Insektenwirten beeinflussen. Die Vorbereitung und Pflege axenischer Larven ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Darmbakterienfunktionen. Die Hauptvorteile dieses Protokolls sind, dass Pflanzengewebekultur verwendet wird, um keimfreie Blätter zu erhalten, um axenische blätterfressende Insekten zu erhalten, die aus oberflächensterilisierten Eiern stammen, und dass diese Methode nicht durch künstliche Diäten eingeschränkt ist.
Diese Methode ist bequem und erhöht die Sichtbarkeit der Aufrechterhaltung axenischer Insekten für zukünftige Darmbakterienstudien, insbesondere für Nicht-Modellinsekten ohne gut entwickelte künstliche Diäten. Halten Sie die P.versicolora-Population in einer Wachstumskammer bei 27 Grad Celsius und 70% relativer Luftfeuchtigkeit, mit einer 16-stündigen hellen und einer achtstündigen dunklen Photoperiode. Legen Sie die Insekten in perforierte Plastikboxen mit gekipptem, nass absorbierendem Papier und füttern Sie sie mit frischen Pappelzweigen.
Sprühen Sie sauberes Wasser auf das absorbierende Papier, um die Feuchtigkeit zu erhalten, und wechseln Sie die Zweige alle zwei Tage. Isolieren Sie Erwachsene für die Eiablage nach der Verpuppung und füttern Sie sie mit zarten Blättern, um mehr Eier zu erhalten. Sammeln Sie innerhalb von 24 Stunden neu gelegte Eier und legen Sie sie 60 Stunden lang auf feuchtes, absorbierendes Papier, um axenische Larven vorzubereiten.
Bereiten Sie MS-Medium in einem Milligramm pro Milliliter Alpha-Naphthalin-Essigsäure oder NAA-Stammlösungen vor. In einer Biosicherheitshaube 50 Mikroliter der NAA-Stammlösung zu 500 Milliliter MS-Medium geben und schütteln, um gut zu mischen. Gießen Sie dann ca. 50 Milliliter pro Gewebekulturbehälter und warten Sie auf die Erstarrung.
Sterilisieren Sie Skalpelle und Pinzetten in einer Alkohollampenflamme in der Biosicherheitshaube. Schneiden Sie drei bis vier Zentimeter große Stielsegmente mit apikalen Knospen oder lateralen Knospen aus Pappelsämlingen nach etwa einem Monat Wachstum und fügen Sie sie in das Kulturmedium ein, ein oder zwei Stielsegmente pro Behälter. Inkubieren Sie diese Stammsegmente in einer Wachstumskammer für ca. 30 Tage.
Und verwenden Sie diese keimfreien Blätter, um die axenischen Larven zu füttern. Autoklav Petrischale, Pinsel, Filterpapier, destilliertes Wasser in einer Petrischale mit LB-Agar-Medium. Blätter mit anhaftenden Eiern in eine Petrischale geben.
Entfernen Sie dann vorsichtig die Eier mit einer Pinzette von den Blättern und geben Sie sie in eine andere Petrischale. Waschen Sie diese Eier acht Minuten lang mit 75% Ethanol. Dann wiederholen Sie die Wäsche viermal mit sterilem Wasser.
Übertragen Sie die Eier auf LB-Agarmedium, um Feuchtigkeit für das Schlüpfen zu erhalten. Legen Sie die Petrischale in eine Wachstumskammer und warten Sie, bis die Eier innerhalb von 24 Stunden geschlüpft sind. Gießen Sie in einer Biosicherheitshaube drei Stücke nasses Filterpapier in eine Petrischale und legen Sie keimfreie Pappelblätter auf das Papier.
Sammle die Larven und lege sie auf die Blätter. Verschließen Sie die Petrischale mit Parafilm und inkubieren Sie sie in einer Wachstumskammer. Wechseln Sie die Blätter alle zwei Tage.
Für die konventionell aufgezogenen Gruppen die Eier von den Blättern in eine Petrischale mit feuchtem Filterpapier geben und diese Larven mit keimfreien Pappelblättern füttern. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip drei Larven im ersten, zweiten und dritten Stadium aus den keimfreien und konventionell aufgezogenen Gruppen aus. Sezieren Sie die Larven des dritten Stadiums mit sterilen Scheren und Pinzetten unter einem Stereomikroskop und sammeln Sie ihre Eingeweide in Mikrozentrifugenröhrchen.
Sammeln Sie intakte Larven im ersten und zweiten Stadium in Röhren. Fügen Sie 100 Mikroliter PBS und drei Stahlkugeln zu den 1,5-Milliliter-Rohren hinzu und mahlen Sie die Gewebe mit einem Perlenschlag-Homogenisator zu Homogenaten. Fügen Sie 100 Mikroliter des Homogenats mit einem sterilen Glasstreustab zu LB-Agarmedium und -platte hinzu.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 24 Stunden. Dann beobachten Sie die Bakterienkolonien. Extrahieren Sie die gesamte DNA der zuvor erhaltenen Gewebe mit einem DNA-Extraktionskit und messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer.
Amplifizieren Sie das bakterielle 16S rRNA-Gen mit universellen 16S rRNA-Primern mit PCR und richten Sie die Reaktion wie im Textmanuskript beschrieben ein. Lagern Sie die PCR-Produkte bis zur weiteren Analyse bei vier Grad Celsius. Mischen Sie die PCR-Produkte mit Nukleinsäurefarbstoff und analysieren Sie sie mittels Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel in 1X TAE-Puffer.
Verwenden Sie 10 Mikroliter eines DNA-Markers als Referenz. Beobachten Sie das Gel mit einem UV-Transilluminator und suchen Sie nach dem Zielfragment um 1.500 Basenpaare. Obwohl in keiner keimfreien Gruppe Bakterienkolonien beobachtet wurden, wurden sie in allen konventionell aufgezogenen Gruppen beobachtet, was darauf hindeutet, dass Larven aus sterilisierten Eiern, die mit gewebekultivierten Pappelblättern gefüttert wurden, keine Bakterien enthielten.
Die 1.500 Basispaar-PCR-Bänder erschienen in allen konventionell aufgezogenen Gruppen. Im Gegensatz dazu wurde in den keimfreien Gruppen oder der Negativkontrolle keine Bande beobachtet, was darauf hindeutet, dass in axenischen Larven keine Darmbakterien existierten. Für Insektenarten mit winzigen Eiern mussten die Arten von Desinfektionsmitteln und die Sterilisationsdauer optimiert werden.
Darüber hinaus sollten Endophyten in gewebekultivierten Pflanzen bemerkenswert sein. Dieses Protokoll bietet eine neue Methode zur Erhaltung keimfreier Insekten, die ein praktisches Werkzeug ist, um Insekten-Darm-Bakterien-Interaktionsstudien zu erleichtern, insbesondere für Nicht-Modell-Insekten ohne gut entwickelte künstliche Diäten.
