Die zellbasierte Therapie hat ein enormes Potenzial für die Regeneration des Gehirns. Das Protokoll, das wir hier demonstrieren, ist wertvoll, da es eine longitudinale In-vivo-Bildgebung von transplantierten Zellen im Gehirn der Maus ermöglicht. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, um Erkenntnisse über die Migration und das Überleben des Transplantats im selben Tier über einen bestimmten Zeitraum zu gewinnen.
Dieses Verfahren kann auf jede Luciferase-exprimierende Zelllinie angewendet werden, die in das Gehirn der Maus transplantiert wird. Die Signalstärke kann jedoch je nach Tiefe der Transplantation oder der Luciferase-Expression in der jeweiligen Zelllinie variieren. Demonstriert wird das Verfahren von Rebecca Weber, einer exzellenten Doktorandin in unserem Labor.
Beginnen Sie mit dem Sammeln einer Durchstechflasche mit Zellen aus dem Lager von minus 150 Grad Celsius und bringen Sie sie ins Labor. Bringen Sie die Durchstechflasche schnell für zwei bis drei Minuten in ein bei 37 Grad Celsius temperiertes Wasserbad, bis sich Eiskristalle auflösen. Übergeben Sie dann die Durchstechflasche in die Biosicherheitskabine und pipettieren Sie den gesamten Inhalt in ein steriles 15-Milliliter-Konusröhrchen.
Fügen Sie neun Milliliter steriles PBS hinzu und zentrifugieren Sie bei 300 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration, ohne das Pellet zu stören, und zählen Sie die Zellen vor dem endgültigen Spin mit einem automatisierten Zellzähler. Transportieren Sie das Tier von der Induktionskammer zum stereotaktischen Rahmen und halten Sie die Anästhesie mit einer Gesichtsmaske aufrecht.
Tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern. Rasieren Sie die Kopfhaut der Maus mit einem elektrischen Rasierer und desinfizieren Sie die Haut mit 5% Betadinlösung mit Wattestäbchen. Befestigen Sie den Mauskopf und setzen Sie die Ohrstangen in den äußeren Meatus ein.
Bohren Sie mit einem chirurgischen Zahnbohrer ein Loch mit einem Durchmesser von zwei bis drei Millimetern durch den Schädel. Suspendieren Sie die vorbereiteten Zellen im Röhrchen und ziehen Sie zwei Mikroliter Zellsuspension in eine Spritze. Platzieren Sie die Spritze über der Zielstelle und bewegen Sie die Nadel langsam an die Oberfläche der Dura und berechnen Sie die Tiefenkoordinaten.
Doppelklicken Sie auf das Symbol der Living Image-Software und wählen Sie eine Benutzer-ID aus der Dropdown-Liste aus. Klicken Sie dann in der angezeigten Systemsteuerung auf Initialisieren. Aktivieren Sie in der Living Image-Software die Kontrollkästchen "Lumineszierend" und "Fotografieren" in der Systemsteuerung und wählen Sie "Automatische Belichtung".
Wählen Sie ein Sichtfeld aus. Geben Sie die Betreffhöhe ein und wählen Sie die Option Motivhöhe-Fokus verwenden aus. Stellen Sie die Filterparameter manuell ein, einschließlich Large Binning, F / Stop, blockierter Erregungsfilter und offener Emissionsfilter.
Injizieren Sie das Luciferin intraperitoneal und betäuben Sie die Tiere nach fünf Minuten mit einer kontinuierlichen Isofluranversorgung. Rasieren Sie die sedierten Tiere auf der Kopfregion mit einem herkömmlichen Haarrasierer. Legen Sie das Tier in die Bildgebungskammer und beginnen Sie 15 Minuten nach der Luciferin-Injektion mit der Bildgebung, indem Sie in der Systemsteuerung auf Erfassen klicken.
Vor der Transplantation neuronaler Vorläuferzellen im Gehirn der Maus wurden die Zellen auf eine erfolgreiche Transduktion durch Expression von EGFP in vitro getestet. Die erfolgreiche Transplantation wurde durch das Vorhandensein des roten Firefly-Luciferase-Signals bestätigt. Nach der Transplantation von 6.000 bis 180.000 Zellen in den rechten sensomotorischen Kortex der Maus war das Biolumineszenzsignal in allen Konzentrationen nachweisbar.
Die Zellen überlebten nach der Transplantation mindestens fünf Wochen. Die transplantierten Zellen wurden in einer anschließenden histologischen Analyse durch den EGFP-Reporter und die Immunfärbung mit antimenschlichen Kernen ex vivo erfolgreich nachgewiesen. Es ist sehr wichtig, die Injektionskoordinaten sorgfältig zu berechnen, um zu vermeiden, dass die Zielstelle verfehlt wird.
Lassen Sie die Spritze nach der Transplantation mindestens fünf Minuten an Ort und Stelle, um Reflux zu vermeiden. Nach der in vivo biolumineszenten Bildgebung kann das Hirngewebe entweder für die histologische Analyse vorbereitet werden, oder die transplantierten Zellen können mittels FACS isoliert und mit verschiedenen oder gemischten Technologien charakterisiert werden. Insgesamt bietet diese Technik eine quantitative und kontinuierliche Verfolgung von transplantierten Zellen im Gehirn und kann auf eine Vielzahl von neurologischen Erkrankungen wie Schlaganfall und traumatische Hirnverletzung angewendet werden.
