Unser Forschungsteam entwickelt Technologien und Protokolle für die Kryo-Elektronenmikroskopie und Kryo-Elektronentomographie. Wir haben Protokolle für die Mikrostrukturierung von TEM-Gittern entwickelt, um das Zellwachstum und die Positionierung für Kryo-ET-Experimente zu steuern. Die Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie wird verwendet, um Nanometer-Auflösungsstrukturen makromolekularer Komplexe in Zellen herzustellen, die in einem nativen gefrorenen hydratisierten Zustand konserviert sind.
Mikrostrukturierung kann den Durchsatz von Ganzzell-Kryo-ET-, kryokorrelativen Lichtelektronenmikroskopie- und kryofokussierten Ionenstrahl-Fräsexperimenten erhöhen. Die Anzahl und Verteilung der Zellen auf EM-Gittern ist entscheidend für ganzzellige Kryo-ET-Studien. Dieses Protokoll bietet eine schnelle, reproduzierbare und weitgehend anpassbare Methode, um das Zellwachstum auf EM-Gittern durch Mikrostrukturierung zu steuern.
Der Forscher sollte sich mit Pipetten, Pinzetten, grundlegenden Zellkulturtechniken sowie Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopen wohl fühlen. Verwenden Sie beim erstmaligen Patterning eine bekannte Zelltyp- und ECM-Kombination und testen Sie diese auf Deckgläsern oder MatTek-Schalen. Mitglieder des Forschungsteams, die an dieser Protokollentwicklung beteiligt sind, sind:Dr.
Brian Sibert, Herr Joseph Kim und Dr. Jae Yang. Um zu beginnen, übertragen Sie die Gitter auf einen Gittervorbereitungshalter und entlüften Sie die Gitter mit der Kohlenstoffseite nach oben. Als nächstes übertragen Sie die Gitter mit der Kohlenstoffseite bis zu einem sauberen Glasobjektträger oder Deckglas mit einem Abstand von mindestens einem Zentimeter zwischen den Gittern.
10 Mikroliter 0,05 Poly-L-Lysin auf jedes Gitter pipettieren und die Gitter in einer feuchten Kammer für mindestens 30 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation wird jedes Gitter dreimal mit 15 Mikrolitern 0,1 molarem HEPES bei pH 8,5 gewaschen. Inkubieren Sie das Gitter in jeder Wäsche für 30 Sekunden und entfernen Sie dann den größten Teil der Flüssigkeit mit einer Pipette aus dem Gitter, ohne das Gitter trocknen zu lassen.
Nach der letzten Wäsche lassen Sie jedes Gitter in 15 Mikrolitern 0,1 molaren HEPES. Bereiten Sie als Nächstes die PEG-SVA-Lösung vor und ersetzen Sie sofort die HEPES-Lösung auf den Gittern durch 10 Mikroliter der PEG-SVA-Lösung, dann inkubieren Sie die Gitter in einer Feuchtkammer für mindestens eine Stunde. Waschen Sie nach der Inkubation jedes Gitter dreimal mit 15 Mikrolitern sterilem Wasser und inkubieren Sie das Gitter in jeder Wäsche für 30 Sekunden.
Nach der letzten Wäsche lassen Sie jedes Gitter in 15 Mikroliter Wasser. Legen Sie einen Ein-Mikroliter-Tropfen Wasser auf die Mitte eines neuen sauberen Deckglases und übertragen Sie dann vorsichtig das Gitter vom 15-Mikroliter-Wassertropfen auf den Tropfen auf dem neuen Deckglas mit der Kohlenstoffseite nach oben. Als nächstes platzieren Sie die PDMS-Schablone vorsichtig über dem Gitter, halten Sie das Gitter zentriert und minimieren Sie den Schablonenkontakt mit der Kohlenstofffolie des Gitters.
Dann fügen Sie einen Mikroliter PLPP-Gel auf das Gitter und pipettieren Sie vorsichtig, um es zu mischen. Bewegen Sie das Deckglas mit dem Gitter zum Trocknen an eine dunkle Stelle. Das Gel trocknet in 15 bis 30 Minuten.
Öffnen Sie für die Mikrostrukturierung die Software mit einer Live-Hellfeldansicht vom Mikroskop aus. Um eine neue Vorlage für eine erste Ausführung zu entwerfen, wählen Sie ROI hinzufügen und dann einen Kreis von 3.000 Mikrometern aus. Positionieren Sie den Kreis-ROI über dem Raster, indem Sie das Brightfield-Bild auf dem Bildschirm als Richtlinie verwenden, und drücken Sie dann die Sperre, um den ROI zu sichern.
Nachdem Sie den ROI gesperrt haben, wählen Sie Muster hinzufügen und wählen Sie das entsprechende Muster aus. Generieren Sie mithilfe der Replikationsoptionen Kopien des ursprünglichen Musters, um einen quadratischen Rasterbereich von acht mal acht zu erstellen. Passen Sie den Abstand und den Winkel nach Bedarf an, um die Muster an den Rasterquadraten auszurichten.
Positionieren Sie das Muster in einer Ecke des Rasters. Duplizieren Sie als Nächstes das Muster und platzieren Sie eine Kopie in jeder der vier Ecken des Rasters, indem Sie die Mikroskopstufe nach Bedarf für jede Region bewegen. Verwenden Sie die Replikationsoptionen, um einen quadratischen Bereich mit acht mal acht Rastern in einen bereich mit zwei mal acht Rasterquadraten zu ändern, der auf beiden Seiten der Mitte platziert werden soll.
Lassen Sie die mittleren vier Rasterquadrate ungemustert. Passen Sie bei Bedarf für jedes Muster die Gesamtdosis an. 30 Millijoule pro Quadratmillimeter sind ein guter Ausgangspunkt.
Wiederholen Sie unter Expertenoptionen das Anpassen des Winkels, der Position, des Abstands zwischen und des Verhältnisses des Musters, um die Ausrichtung des Musters an den Rasterquadraten zu verfeinern. Bewegen Sie den Mikroskoptisch, um den Rasterbereich in der Brightfield-Anzeige zu ändern. Sobald die Vorlage und die Muster positioniert sind, deaktivieren Sie alle Bereiche bis auf einen im Aktionsbereich der Software.
Verwenden Sie den Mikroskoptisch, um zu diesem Bereich zu navigieren und konzentrieren Sie sich auf die Kohlenstofffolie. Klicken Sie auf das Augapfelsymbol im Aktionsfenster, um die Muster-Overlay-Anzeige auszuschalten. Sobald das Raster scharf ist, schließen Sie den Brightfield-Verschluss und drücken Sie das Wiedergabesymbol in der unteren rechten Ecke der Software, um den Musterungsprozess zu starten, der live überwacht werden kann.
Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Bereiche strukturiert sind. Zum Schluss den Deckglas mit dem Gitter aus dem Mikroskop entfernen und sofort 10 Mikroliter steriles PBS auf das Gitter geben. Nach 10 Minuten die Schablone mit einer Pinzette entfernen, dann das Gitter dreimal mit 15 Mikrolitern PBS waschen und jedes Gitter in PBS an einem dunklen Ort lassen.
Bereiten Sie 15 Mikroliter der extrazellulären Matrix für jedes Gitter vor, ersetzen Sie dann das PBS aus jedem Gitter durch 15 Mikroliter der extrazellulären Matrix und inkubieren Sie das Gitter in einer feuchten Kammer für mindestens eine Stunde. Waschen Sie nach der Inkubation jedes Gitter fünfmal mit 15 Mikrolitern sterilem PBS, wie zuvor gezeigt. Lassen Sie nach der letzten Wäsche jedes Gitter in PBS.
Mit einem Fluoreszenzmikroskop das Fluorophor in der extrazellulären Matrix nachweisen, um die Musterung zu bestätigen und dass die Kohlenstofffolie intakt bleibt. HeLa-Zellen, die auf mikrogemusterte und ungemusterte TEM-Gitter gesät werden, sind durch fluoreszierende Färbung mit einem Calcein AM- und Ethidium-Homodimer-1-basierten Zelllebensfähigkeitstest sichtbar. Unter Verwendung einer gemischten extrazellulären Kollagen- und Fibrinogenmatrix haften HeLa-Zellen leicht an Mustern im gesamten Gitter.
Die Gesamtmorphologie von Zellen, die sich entlang des Musters ausdehnten, ähnelt der von Zellen, die auf ungemusterten Gittern gezüchtet wurden. Ein Hellfeldbild von RSV-infizierten BEAS-2B-Zellen 18 Stunden nach dem Seeding zeigt Zelladhäsion und -wachstum entlang der zentralen Region des Musters. Die meisten infizierten Zellen befinden sich entlang des zentralen Bereichs mit höherer Dichte des Gradientenmusters.
Die RSV-Varianten befinden sich in der Nähe der Peripherie der infizierten BEAS-2B-Zellen, die auf mikrostrukturierten Gittern gezüchtet wurden. Viele RSV-Strukturproteine werden in den Tomogrammen identifiziert, einschließlich des Nukleokapsidsids und des viralen Fusionsproteins. Auf mikrostrukturierten Gittern können Drosophila-Neuronen mit pannononaler GFP-Expression aufgrund der fluoreszierenden Markierung und ihrer Lage innerhalb der Mikromuster leicht durch Lichtmikroskopie verfolgt werden.
Neuronen auf ungemusterten Gittern können auch durch GFP-Signalisierung durch Lichtmikroskopie verfolgt werden. Die Lokalisierung in der Kryo-Elektronenmikroskopie wird jedoch aufgrund von Zelltrümmern und Verunreinigungen durch die Medien schwierig. Aufgrund der Abmessungen des Neuronenzellkörpers und der ausgedehnten Neuriten werden Kryo-Elektronentomographie-Neigungsreihen entlang dünnerer Regionen der Zellen mit höherer Vergrößerung gesammelt.
Die neuronale Zellmembran, Mitochondrien, Mikrotubuli, Aktinfilamente, vesikuläre Strukturen und Makromoleküle wie Ribosomen sind in Bildmontagen mit höherer Vergrößerung gut aufgelöst und schneiden durch das 3D-Tomogramm. Ähnliche subzelluläre Merkmale werden aus 3D-Tomogrammen ungemusterter Neuronen beobachtet. Das Auftragen der Schablone auf das Gitter und das Hinzufügen des PLPP-Gels ist der empfindlichste Schritt, der die Musterungsergebnisse beeinflussen kann und mit Vorsicht erfolgen sollte.
Cryo-CLEM kann verwendet werden, um interessante Ziele in Zellen für die Kryo-ET-Datenerfassung zu lokalisieren. Cryo-FIB-REM kann verwendet werden, um Zellen auf Bereichen zu verdünnen, die sonst zu dick für die Datenerfassung sind.
