Die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen liefert ein Verständnis für die Regulation vieler biologischer Prozesse. Hier demonstrieren wir eine von Y John Schuh und Co. zunächst beschriebene Vorgehensweise. Arbeiter im Jahr 2007, wo die Autoren BiFC in Kombination mit FRET verwendet haben, um die dreigliedrige Interaktion zwischen drei Proteinmolekülen zu validieren.
Wir haben jedoch Fluoreszenzlebensdauermessungen in dieses Verfahren einbezogen, um FRET-Messungen zu untermauern. Um eine dreigliedrige Wechselwirkung zu demonstrieren, haben wir ein Protein gewählt, von dem bekannt ist, dass es homodimerisiert. Darüber hinaus wurde es auch intern validiert, um mit einem Kalziumsensor des Proteins zu interagieren, der in diesem Protokoll als C-Protein bezeichnet wird.
Die MNC-Proteine interagieren im Zytoplasma. Bei dieser Technik werden zwei Proteine mit gespaltenen YFP-Proteinen markiert. Ihre Interaktion führt zur Restitution von funktionellem YFP, das als FRET-Akzeptor für den dritten interagierenden Partner fungiert, der mit CFP als FRET-Spender markiert ist.
Beginnen Sie mit der Amplifikation der kodierenden Sequenzen der interessierenden Gene, die in unserem Fall M- und C-Gene sind, durch PCR und klonen Sie sie in geeigneten Eintrittsvektoren. Validierung von Klonen, die auf den Antibiotika enthaltenden Platten ausgewählt werden, durch Restriktionsverdauung und DNA-Sequenzierung. Mobilisieren Sie die rekonstituierten CDS'von Entry Clones zu den Zielvektoren.
Alle in diesem Experiment verwendeten Vektoren sind in Tabelle eins aufgeführt. Schließlich transformieren Agrobakterium GV3101 Zellen mit den Zielvektoren durch Elektroporation. Hier wachsen wir Nicotiana Benthamiana Pflanzen noch vier bis sechs verlassen Stadium unter kontrollierten Bedingungen in einer Wachstumskammer.
Bereiten Sie die Bodenmischung vor, indem Sie Bodenrit, Kokostorf und Kompost im Verhältnis 2:1:1 mischen. Verteilen Sie eine ein Zoll dicke Schicht dieser Mischung in einem Plastiktablett, um den Bodenbett zu machen und ihn mit etwas Wasser zu sättigen. Streuen Sie etwa 200 Samen auf den Boden und geben Sie sie in ein größeres Tablett, das etwa einen Zentimeter stehendes Wasser enthält.
Decken Sie dieses Tablett mit Plastikfolie ab, um eine Feuchtigkeitskammer zu schaffen. Übertragen Sie dieses Tablett in eine Wachstumskammer bei 23 Grad Celsius mit 16 Stunden Licht- und achtstündigem Dunkelzyklus. Nach zwei Wochen die jungen Sämlinge in kleine drei bis vier Zoll große Töpfe mit wassergesättigter Bodenmischung überführen.
Legen Sie diese Töpfe in ein Plastiktablett und übertragen Sie sie für weitere vier Wochen in die Wachstumskammer. Für die Agroinfiltration müssen die Bakterienstämme frisch subkultiviert und zusammen mit dem P19-Stamm des Agrobakteriums in geeigneten Verhältnissen gemischt werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie GV3101-Agrobakterienstämme, die BiFC- und FRET-Konstrukte enthalten, aus Streifenplatten in 10 ml impfen.
zur Brühe mit entsprechenden Antibiotika. Daneben initiieren Sie auch eine Kultur von P19 Stamm von Agrobakterien, die hinzugefügt wird, um Transgen-Silencing zu verhindern. Decken Sie den Kolben mit Aluminiumfolie ab und bewahren Sie ihn in einem Inkubator-Shaker auf, stellen Sie ihn 16 Stunden lang auf 28 Grad Celsius bei 170 U / min.
Nach dem Wachstum über Nacht werden 1 ml. dieser Kulturen in eine Einweg-Elle übertragen, um die optische Dichte bei 600 Nanometern mit einem Spektralphotometer zu messen. Mischen Sie die Kulturen geeigneter BiFC- und FRET-Partner-haltiger Stämme, so dass das endgültige OD 0,5 und das von P19 0,3 in einem Gesamtvolumen von 2 ml beträgt.
Um diese Verhältnisse zu erreichen, folgen wir der Formel, die auf dem Bildschirm für diese Berechnungen angezeigt wird. Die gemischten Agrobakterienkulturen bei 3000G fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen. Suspendieren Sie die Pellets in einem 2 ml.
Infiltrationspuffer. Möglicherweise müssen Sie einen Wirbelmischer verwenden, um die Zellen in einer homogenen Zellsuspension vollständig wieder zu suspendieren. Danach inkubieren Sie die Röhren bei Raumtemperatur im Dunkeln für drei Stunden.
Beschriften Sie in der Zwischenzeit jeden Pflanzentopf für die Konstruktmischung, mit der er infiltriert wird. Füllen Sie eine 1 ml. nadellose Spritze mit der agrobakteriellen Mischung.
Drücken Sie die Spritzenspitze vorsichtig, aber fest auf die Abaxialseite eines vollständig expandierten Blattes, während Sie das Blatt von der anderen Seite stützen. Drücken Sie den Kolben vorsichtig, bis sich die Lösung im Blattbereich füllt, was dem Zwei- bis Dreifachen der Spritzenspitze entspricht. Infiltrieren Sie die Bakterienmischung an bis zu vier Stellen auf einem Blatt und wiederholen Sie diesen Vorgang für drei bis vier Blätter für eine Art der Infiltration.
Fügen Sie außerdem mindestens zwei Pflanzen pro Konstrukt für die Infiltration hinzu. Denken Sie daran, Ihre Hände mit 70% Alkohol abzuwischen oder Ihre Handschuhe zu wechseln, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Alle Töpfe in ein Tablett geben und in der Wachstumskammer unter dem gleichen Wachstumszustand inkubieren.
Überprüfen Sie einen kleinen Teil des agroinfiltrierten Blattes mit einem Fluoreszenzmikroskop. Wenn die Fluoreszenz von YFP und CFP in Zellen nachweisbar ist, gehen Sie zum konfokalen Mikroskop für den BiFC FRET-FLIM-Assay. In unserem Fall wurde diese Analyse drei Tage nach der Agroinfiltration durchgeführt.
Jetzt, da die Pflanzen bereit sind, unter einem Mikroskop visualisiert zu werden, schneiden Sie quadratische Blattproben von fünf bis 8 mm entfernt von der Spritzenspitzenwunde ab und montieren Sie sie auf destilliertem Wasser. Legen Sie einen sauberen Deckel darüber und verschließen Sie ihn.
Visualisieren Sie diese Proben im konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. In diesem Verfahren ist die Grundlage für die Bestimmung und Quantifizierung der Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen die Verringerung der Fluoreszenzlebensdauer des FRET-Donorpartners bei seiner Interaktion mit dem Akzeptor, die zur Berechnung der Effizienz von FRET verwendet wird. Die Komplexität im Falle der dreigliedrigen Wechselwirkung nimmt weiter zu, da der FRET-Akzeptor in diesem Fall kein einzelnes Molekül ist, sondern ein gespaltenes YFP BiFC-Paar, das zunächst in vivo rekonstituiert werden sollte, um ein funktionelles FRET-Akzeptor-Fluorophor zu werden.
Um FRET-FLIM durchzuführen, müssen wir die Fluoreszenzlebensdauer der Donormoleküle bestimmen, zuerst allein und dann in Anwesenheit eines FRET-Partners. Öffnen Sie die FLIM-Anwendung im konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, starten Sie die Konsole und verwenden Sie die Mustererkennungsphotonenzählung, um die Fluoreszenzlebensdauer zu messen. Wählen Sie den Standardmäßigen Messmodus für die Messung aller Photonen.
Wir werden zwei Arten von agroinfiltrierten Pflanzen nehmen. Eine, die das CCFP-Gen hat und die andere, die CCFP zusammen mit MYFP hat, weil die Interaktion des M-Proteins bereits mit dem C-Protein unter Verwendung von BiFC und Y2H validiert wurde, erwarten wir eine gute FRET-Effizienz mit diesem interagierenden Paar. Jetzt scannen wir zuerst das CCFP-agroinfiltrierte Blatt und suchen nach einer Zelle, die eine gute CFP-Fluoreszenz aufweist.
Die Mikroskopeinstellungen werden auf dem Bildschirm angezeigt. Die Probe wird mit ausreichender Laserleistung beleuchtet, um etwa 0,1 Photonen pro Puls zu erreichen. Für Proben mit variabler Fluoreszenzintensität erfassen wir 50 Bilder, um ausreichende Photonen zu sammeln, die für die Lebensdauermessung erforderlich sind.
Da bekannt ist, dass CFP aufgrund seiner bestätigenden Anpassung zwei Fluoreszenzlebensdauern aufweist, füttern wir die Daten mit einem exponentiellen Rekonvolutionsmodell, während der Wert von N gleich zwei bleibt. Bei diesen Einstellungen sind die beiden Lebensdauern bei einer und 3,2 Nanosekunden sichtbar. Wir werden die höhere Lebensdauer für alle nachfolgenden Berechnungen verwenden.
Wir sind nun bereit, den FRET zwischen CCFP und MYFP zu messen. Verwenden wir dazu die Blattprobe aus der agroinfiltrierten Pflanze mit CCFP und MYFP. Wir suchen nach einer Zelle, die sowohl CCFP als auch MYFP exprimiert und ihre jeweiligen Emissionsmuster bestätigt, indem wir sie mit einem vollen 40-Nanometer-Pulslaser und einem 514-Nanometer-Weißlichtlaser anregen.
Danach wechseln wir zur FLIM-Konsole, um die Lebensdauer von CFP mit den gleichen Einstellungen zu messen, die wir zuvor zum Messen der Lebensdauer von CCFP verwendet haben. Aber dieses Mal exprimiert die Zelle auch MYFP, das möglicherweise mit CCFP interagieren und eine Verringerung der Lebensdauer von CCFP verursachen kann. Wenn wir die Grafik gelesen haben, die mit dem exponentiellen Rekonvolutionsmodell N mit N gleich zwei erhalten wurde, gibt es tatsächlich eine Abnahme der CFP-Lebensdauer von 3,2 auf 2,6 Nanosekunden.
Wir starten nun die FRET-Konsole in der Software und berechnen die FRET-Effizienz, indem wir die unbestreitbare Lebensdauer manuell in die in der Software bereitgestellte Gleichung eingeben, und die beobachtete FRET-Effizienz beträgt 56%. Dazu nehmen wir die Blattprobe von einer Pflanze, die mit CCFP und MYFPN mit MYFPC co-infiltriert wurde. Wir scannen die Blattpflanze nach einer Zelle, die sowohl CFP als auch rekonstituierte YFP-Fluoreszenz zeigt, die aus der Interaktion zwischen zwei M-Proteinen hervorgeht.
Wir verwenden die gleiche Laser- und Emissionswellenlänge wie zuvor. Anschließend schalten wir den 514-Nanometer-Laser aus und wechseln zur FLIM-Konsole. Wenn das MYFP-Dimer mit CCFP interagiert.
Wir sollten eine Verringerung der Lebensdauer von CCFP sehen, wie sie während seiner Interaktion mit MYFP beobachtet wurde. Wenn das CCFP jedoch nicht mit dem MYFP-Dimer interagiert, sollte seine Fluoreszenzlebensdauer bei 3,2 Nanosekunden bleiben. Mit den oben genannten ähnlichen Einstellungen messen wir die CFP-Lebensdauer in Gegenwart von rekonstituiertem YFP.
Wir passen den Graphen mit dem N-Exponentialrekonvolutionsmodell mit einem Äquivalent zu zwei an und bewegen uns zur FRET-Konsole. Und ja, es gibt einen Rückgang der CFP-Lebensdauer von 3,2 auf 2,3 Nanosekunden. Wir berechnen den FRET-Wirkungsgrad wie oben beschrieben.
Der berechnete FRET-Wirkungsgrad beträgt 55%Hier haben wir FLIM verwendet, um die Fluoreszenzlebensdauer des FRET-Donorpartners in Gegenwart und Abwesenheit des FRET-Akzeptors zu messen. Eine Verkürzung der Fluoreszenzlebensdauer des Donors wurde erwartet, wenn es eine positive Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen gab. Im Falle einer Positivkontrolle sind dies CCFP und MYFP.
Wir beobachten eine Verringerung der Fluoreszenzlebensdauer des Donors von 3,3 auf 2,5 Nanosekunden und die FRET-Effizienz betrug 56%Eine ähnliche Übung mit rekonstituiertem YFP resultierte aus der Wechselwirkung zwischen zwei Amonomeren und C-Proteinen und führte auch zu einer positiven FRET-Interaktion, die zur Verringerung der Fluoreszenzlebensdauer des Donors auf 2,6 Nanosekunden führte. Der berechnete FRET-Wirkungsgrad lag in diesem Fall bei etwa 55%. Die Verkürzung der Fluoreszenzlebensdauer des FRET-Donors liefert einen starken Beweis für eine dreigliedrige Wechselwirkung zwischen diesen Proteinen.
Das hier beschriebene Protokoll ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um dreigliedrige Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen zu bestimmen. Dieses Verfahren kann auch dazu beitragen, die intrazelluläre Lokalisation der resultierenden Komplexe zu bestimmen, was wichtig ist, um die Funktion und physiologische Bedeutung eines Proteinkomplexes zu entschlüsseln. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der BiFC-basierte FRET-FLIM-Assay die Möglichkeit bietet, wichtige Aspekte dreigliedriger Proteininteraktionen zu untersuchen und zu charakterisieren, die bei Protein-Protein-Interaktionsstudien sowohl in tierischen als auch in pflanzlichen Systemen hilfreich sein können.
