Dieses Protokoll bietet eine einfache, schnelle und reproduzierbare Methode, um eine skalierbare stumpfe Schädel-Hirn-Trauma bei erwachsenen Zebrafischen zu induzieren. Die erwachsenen Zebrafische, die diese stumpfe traumatische Hirnverletzung erleiden, weisen viele der Merkmale auf, die bei Menschen beobachtet werden, die an einer stumpfen Kraft TBI leiden. Das Verfahren wird von Herrn James Hentig und Frau Kaylee Cloghessy, zwei Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert.
Beginnen Sie mit dem Füllen einer Petrischale mit Modelliermasse. Verwenden Sie dann Finger oder die Rückseite einer Pinzette, um eine erhöhte Plattform mit zusätzlicher Modelliermasse zu erstellen. Teilen Sie die erhöhte Plattform der Länge nach mit einer Rasierklinge in zwei ungefähr gleiche Hälften.
Bilden Sie die beiden Hälften zu einem Kanal, so dass er die Länge eines erwachsenen Fisches aufnimmt. Verwenden Sie zusätzlichen Lehm, um Wände zu bauen, um 2/3 des Fischkörpers mit freiliegendem Kopf zu sichern. Formen Sie eine kleine Stütze im freiliegenden Kopfbereich senkrecht zu den Wänden, um eine Rotation oder einen Rückstoß des Kopfes bei Verletzungen zu vermeiden.
Stellen Sie sicher, dass die Seiten des Kanals das abfallende Gewicht nicht behindern. Verwenden Sie einen Mini-Locher, um eine 3-Millimeter-Stahlscheibe aus einem 22-Gauge-Stahlblitz zu erstellen. Legen Sie einen betäubten Fisch, der nicht auf Schwanzdrücken reagiert, mit der Dorsalseite nach oben auf die Tonform im Kanal, so dass sein Körper an den Seiten befestigt ist.
Legen Sie die 3-Millimeter-22-Gauge-Stahlscheibe auf den Kopf, zentriert über den gewünschten Aufprallpunkt. Richten Sie den Fisch senkrecht aus, um zu vermeiden, dass sein Kopf zur Seite kippt, was zu einem ungleichmäßigen Aufprall führen könnte. Verwenden Sie einen Standard-Ringständer und eine Armklemme, um das Stahl- oder Kunststoffrohr zu sichern, und stellen Sie sicher, dass es gerade ist, so dass der Boden des Schlauches 1,5 Zentimeter über dem Kopf des Zebrafisches liegt.
Schauen Sie nach dem Rohr, um sicherzustellen, dass es über der Stahlplatte ausgerichtet ist. Wählen Sie das geeignete Kugellager basierend auf der gewünschten Schwere der Verletzung. Lassen Sie das Kugellager aus einer vorgegebenen Höhe das Rohr hinunter auf die Stahlplatte fallen.
Legen Sie dann die verletzten Fische in das Bergungsbecken, um überwacht zu werden. Füllen Sie eine Petrischale mit Modelliermasse und schaffen Sie einen kleinen Hohlraum, um den Körper während der Dissektion zu unterstützen. Legen Sie den Fisch mit der Rückenseite nach oben in die Tonform.
Platzieren Sie zwei Sezierstifte, einen durch die Mittellinie auf halber Höhe des Körpers und den anderen etwa 5 Millimeter hinter der Basis des Kopfes. Verwenden Sie ein Paar 5 Dumont-Pinzetten, um den Sehnerv stumpf zu durchtrennen und die Augen zu entfernen. Legen Sie ein Ende der 5 Pinzetten unter die rechte Parietalplatte.
Machen Sie eine absichtliche Scherenaktion, die sich in Richtung des Rostralendes bewegt, und entfernen Sie die rechte Frontplatte. Drehen Sie dann den Fisch um 90 Grad im Uhrzeigersinn. Legen Sie ein Ende der 5 Pinzetten unter die linke Parietalplatte und verwenden Sie die gleiche Scherenbewegung, um die linken Parietal- und Frontalplatten zu entfernen und den gesamten dorsalen Aspekt des Gehirns freizulegen.
Verwenden Sie die 5 Pinzetten, um den Oberkiefer stumpf zu durchschneiden, so dass die Riechkolben erhalten bleiben und nicht beschädigt werden. Entfernen Sie mit derselben Pinzette den rechten Operkel, den Präoperkel, den Interoperkel und den Suboperkel. Resezieren Sie dann stumpf die Muskulatur am kaudalen Ende des Kalvarienbergs, um das Rückenmark freizulegen.
Mit der Pinzette stumpf das Rückenmark transektieren. Legen Sie die Pinzette vorsichtig unter das Gehirn und entfernen Sie das Gehirn vorsichtig aus dem Kalvarienberg. Sezieren Sie das gesamte Gehirn oder die Region von Interesse mit den Anweisungen im Textmanuskript und legen Sie das Gehirn sofort mit einer feinen Pinzette auf ein kleines Wiegeboot, wobei Sie darauf achten, das Gehirn nicht zu erstechen oder zu kratzen.
Übertragen Sie das Gehirn auf das geteerte Trocknungswiegeboot und zeichnen Sie das nasse Gewicht des Gehirns auf. Richten Sie die Gehirne so aus, dass sie flach auf dem Wiegeboot mit der Rückenseite nach oben liegen. Dann legen Sie das Gehirn und das Trocknungswiegeboot für acht Stunden in einen Hybridisierungsofen, der auf 60 Grad Celsius eingestellt ist.
Um das Gehirn auf ein neues geteertes kleines Wiegeboot zu übertragen, sobald es trocken ist, kneifen Sie die feine Pinzette zusammen und schöpfen Sie ab der ventralen Seite des Gehirns eine Aufwärtsbewegung ein. Machen Sie einen Teilschnitt auf einem nassen Schwamm. Legen Sie einen Fisch nach dem anderen mit der ventralen Seite nach oben in die Öffnung und injizieren Sie mit einer 30-Gauge-Nadel etwa 40 Mikroliter 10 Millimol EdU in den Körper des Fisches.
Dann bringen Sie den Fisch in den mit Systemwasser gefüllten Fäkalientank zurück. Sammeln Sie die Gehirne wie bereits erwähnt und legen Sie sie als Gruppe in eine 9-Milliliter-Glasfläschchen mit 2 Millilitern von neun Teilen 100% Ethanol zu einem Teil 37% Formaldehyd. Fixiere die Gehirne bei 4 Grad Celsius auf einer Wippplattform.
Verwenden Sie ein Kryostatenfutter, um die Gehirne in TFM in der gewünschten Ausrichtung auf Trockeneis einzubetten. Vaskuläre Verletzungen erwiesen sich als eine der einfachsten und prominentesten Pathologien, um erfolgreiche Verletzungen über dieses Modell zu identifizieren. Die Fähigkeit, den Indikator zu identifizieren, änderte sich mit dem Stamm der Fische, die während der Verletzung verwendet wurden.
Die Identifizierung einer Gefäßverletzung bei Wildtyp AB war aufgrund der Pigmentierung schwer zwischen leichtem oder mittelschwerem TBI und unbeschädigten Kontrollfischen zu unterscheiden. Nach einer Verletzung zeigten die milden TBI-Fische minimale Oberflächenabschürfungen, während die moderaten TBI-Fische eine begrenzte Hirnblutung aufwiesen. Das Ausmaß der Verletzung zeigte sich bei schweren TBI-Fischen.
Im Gegensatz dazu können Gefäßverletzungen bei der Verwendung von Albino- oder Casperfischen leicht identifiziert werden. Schwellungen des Großhirns aufgrund von Verletzungen wurden anhand von Ödemen beurteilt. Im Gegensatz dazu wiesen sowohl moderate TBI als auch schwere TBI signifikante Ödeme, 1 dpi und 3 dpi auf, aber der Flüssigkeitsgehalt sowohl von moderatem TBI als auch von schwerem TBI kehrte zu einem Niveau zurück, das einer unbeschädigten Kontrolle von 5 dpi ähnelte.
Diese stumpfe Kraftverletzung führte zu einer robusten Zellproliferationsantwort, die sich über die Neuroachse erstreckt. Eine erhöhte EdU-Markierung wurde in den ventrikulären und subventrikulären Zonen des Vorderhirns im Vergleich zu unbeschädigten Kontrollen beobachtet. Die verletzten Gehirne zeigten eine erhöhte EdU-Markierung in der periventrikulären Grauzone, den optischen Tektallappen und Aspekten des vorderen Hypothalamus im Vergleich zum unbeschädigten Fischgehirn.
Nach schweren TBI zeigten neurogene Regionen im Hinterhirn im Vergleich zum unbeschädigten Gehirn eine erhöhte Zellproliferation. Stellen Sie für eine ordnungsgemäße Induktion der Verletzung sicher, dass die Fische in der Form gesichert und stabil sind und dass der Schlauch gerade ist, um einen außermittigen Aufprall zu vermeiden oder die Gewichtsabfallbahn zu verändern. Dieses Verfahren bietet eine schnelle und kostengünstige Induktionsmethode für stumpfe Gewaltverletzungen, die auf ein regeneratives Modell angewendet wird, das insbesondere für wiederholte Kopfverletzungen oder verletzungsinduzierte regenerative Studien geeignet wäre.
