Die In-Cell-NMR-Spektroskopie bietet einen einzigartigen Ansatz, um die Proteinstruktur und -funktion direkt in lebenden Zellen zu untersuchen und biologisch relevante Prozesse wie Protein-Ligand-Interaktionen zu überwachen. Dieser NMR-Bioreaktor kann eine große Anzahl menschlicher Zellen für mehrere Tage im Spektrometer lebensfähig und metabolisch aktiv halten und Echtzeit-NMR-Anwendungen in der Zelle ermöglichen. Diese Methode kann auf jedes lösliche, frei taumelnde intrazelluläre Protein angewendet werden, das Konformations- oder chemische Veränderungen erfährt.
Die Isotopenkennzeichnung erweitert die Anwendbarkeit des Verfahrens weiter. Montieren Sie zunächst die Durchflusseinheit mit einem zweiten NMR-Rohr für die Durchflusseinheit, das später durch das mit Zellen enthaltende ersetzt wird. Informationen zur korrekten Montage finden Sie in der Bedienungsanleitung der Durchflusseinheit.
Stellen Sie das an die Durchflusseinheit angeschlossene Wasserbad auf 37 Grad Celsius ein und legen Sie die Reservoirflasche in das Wasserbad. Schließen Sie den FEP-Schlauch der Reservoirflasche an die Pumpe an. Drehen Sie das Bioreaktorventil zum Bypass und füllen Sie die Pumpe mit Medium vor.
Drehen Sie dann das Bioreaktorventil zum Durchfluss und füllen Sie den Bioreaktor mit dem Medium mit 0,1 Millilitern pro Minute vor. Nehmen Sie einen T75-Kolben mit transfizierten HEK 293 T-Zellen aus dem Kohlendioxid-Inkubator und entfernen Sie das verbrauchte Medium. Fügen Sie zwei Milliliter Trypsin EDTA zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, um die Zellen zu lösen.
Inaktivieren Sie das Trypsin mit 20 Millilitern vollständigem DMEM und suspendieren Sie die Zellen gründlich durch Pipettieren auf und ab. Anschließend in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 800X G für fünf Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.
Das Zellpellet in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Verschluss geben. Um die Zellen in Agarosefäden einzubetten, schmelzen Sie ein Aliquot erstarrter Agarose bei 85 Grad Celsius in einer Blockheizung und halten Sie es dann in Lösung bei 37 Grad Celsius in der Blockheizung. Füllen Sie mit einer Pasteur-Pipette den Boden des NMR-Rohrs der Durchflusseinheit mit 60 bis 70 Mikrolitern 1,5% Agarose-Gel und legen Sie es auf Eis, um einen fünf Millimeter hohen Bodenstopfen zu erzeugen.
Erhitzen Sie das Zellpellet für 15 bis 20 Sekunden in der Blockheizung und suspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 450 Mikrolitern Agaroselösung, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Saugen Sie die Zell-/Agarosesuspension in einen 30 Zentimeter langen Chromatographie-PEEK-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,75 Millimetern an, der mit einer Ein-Milliliter-Spritze verbunden ist. Lassen Sie den Schlauch zwei Minuten bei Raumtemperatur abkühlen.
Füllen Sie das NMR-Rohr der Durchflusseinheit mit 100 Mikrolitern PBS bei Raumtemperatur vor. Gießen Sie Fäden von Zellen, die in Agarose eingebettet sind, in das NMR-Rohr der Durchflusseinheit, indem Sie die Spritze vorsichtig drücken. Entfernen Sie das leere NMR-Rohr aus der Durchflusseinheit und erhöhen Sie die Durchflussrate für einige Minuten auf zwei Milliliter pro Minute, um Restgasblasen im Einlassschlauch zu entfernen.
Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,2 Milliliter pro Minute ein und führen Sie die NMR-Röhre mit den Zellen ein, indem Sie sie langsam, aber stetig nach oben drücken. Versorgen Sie das Bioreaktormedium mit einer Durchflussrate von 0,1 Millilitern pro Minute. Stellen Sie die Temperatur im NMR-Spektrometer auf 310 Kelvin ein und setzen Sie die Durchflusseinheit in das Spektrometer ein.
Sobald der Bioreaktor in das NMR-Spektrometer eingeführt wurde, warten Sie einige Minuten, um den Mediumsaustausch zu ermöglichen. Passen Sie die Anpassung und Abstimmung des Protonenkanals an, unterteilen Sie den Magneten und berechnen Sie die Protonen-90-Grad-Hartpulslänge. Passen Sie die Protonenleistungspegel in jeder Pulsfolge entsprechend dem Protonen-Hartpuls an.
Nehmen Sie ein erstes Zgesgp-Protonen-NMR-Spektrum auf, um den Probengehalt in Feldhomogenität aufzuzeichnen. Kopieren Sie das zgesgp und das p3919gp oder die SOFAST-HMQC-Experimente auf die gewünschte Anzahl und stellen Sie sie in den Erfassungsspooler. Injizieren Sie eine konzentrierte Lösung des externen Moleküls in die mittlere Reservoirflasche, indem Sie den Silikonschlauch mit einer sterilen Langnadelspritze durchstechen.
Ersetzen Sie am Ende des NMR-Experiments das Röhrchen mit den Zellen durch ein leeres Rohr und spülen Sie die Durchflusseinheit mit Wasser ab. Für Zellen, die unmarkierte Carboanhydrase exprimieren, verarbeiten Sie die p3919gp-Spektren durch Anwendung der Nullfüllungs- und exponentiellen Linienverbreiterungsfensterfunktion. Für Zellen, die Stickstoff-15-markierte Superoxiddismutase exprimieren, verarbeiten Sie die SOFAST-HMQC-Spektren durch Anwendung der Nullfüllung und der quadratischen Glockenfensterfunktion in beiden Dimensionen.
Importieren Sie in MATLAB die Spektralbereiche mithilfe des benutzerdefinierten Skripts Load_ascii_spectra. Führen Sie das Skript Load_acqus aus, um die Zeitstempel aus den 1D-Spektren zu extrahieren. Öffnen Sie die grafische Benutzeroberfläche von MCR-ALS 2.0, indem Sie das Skript mcr_main ausführen, und laden Sie auf der Registerkarte Datenauswahl die Spektrenmatrix.
Überprüfen Sie die Daten, indem Sie sie plotten. Bewerten Sie die Anzahl der Komponenten, entweder durch Einzelwertzerlegung oder manuell, und wählen Sie eine Methode zur anfänglichen Schätzung der reinen Spektren aus. Es kann entweder die reinste Variablenerkennung oder die Entwicklung der Faktorenanalyse verwendet werden.
Wählen Sie im Fenster Auswahl des Datasets die Option Weiter aus. Legen Sie die Einschränkungen für die Konzentrationen im Fenster Einschränkungen:Zeilenmodus fest. Wenden Sie eine Nicht-Negativitätseinschränkung an, indem Sie fnnls als Implementierung und zwei als Anzahl der Arten auswählen.
Wenden Sie dann eine Schließungsbedingung an, setzen Sie die Einschränkung auf eins, die Schließungsbedingung auf gleich und gelten Sie für alle Arten. Legen Sie die Einschränkungen für die Spektren im Fenster Integritätsregeln:Spaltenmodus fest. Wenden Sie eine Nicht-Negativitätseinschränkung an, indem Sie fnnls als Implementierung und zwei als Anzahl der Arten auswählen.
Legen Sie im letzten Fenster 50 Iterationen und ein Konvergenzkriterium von 0,01 fest. Geben Sie die Ausgabenamen für Konzentrationen, Spektren und Standardabweichungen an. Klicken Sie auf Weiter, um die MCR-ALS-Anpassung auszuführen.
Die Zellen im Bioreaktor können bis zu 72 Stunden am Leben erhalten werden, wie ein Trypan-Blue-Test bestätigt. Der Bioreaktor wurde zur Echtzeitüberwachung der Bindung von zwei Inhibitoren, Acetazolamid und Methazolamid, an Carboanhydrase verwendet, die im Zytosol von HEK 293 T-Zellen überexprimiert wurde. Das Vorhandensein von Signalen aus dem überexprimierten Protein und die Feldhomogenität wurde mit dem ersten erreizungsformenden Protonenspektrum bewertet.
Im Fall der Carboanhydrase wurde die intrazelluläre Bindung der beiden Inhibitoren überwacht, indem Protonensignale im Bereich zwischen 11 und 16 ppm des WATERGATE-Spektrums beobachtet wurden, die aus den Zink-koordinierenden Histidinen und anderen aromatischen Rückständen resultieren. Die erfolgreiche Bindung wurde durch das Auftreten zusätzlicher Signale bestätigt. MCR-ALS wurde verwendet, um die NMR-Signale, die sich aus der freien und gebundenen Carboanhydrase ergeben, zu trennen und die relativen Konzentrationsprofile der beiden Spezies bereitzustellen.
Der Bioreaktor wurde eingesetzt, um die Bildung einer zinkgebundenen intramolekularen Disulfidbindung der Superoxiddismutase zu überwachen, die durch Ebselen, eine Glutathionperoxidase-Nachahmung, gefördert wird. Die MCR-ALS-Analyse an ausgewählten Regionen des 2D-Spektrums trennte die von den beiden Spezies ausgehenden Signale und lieferte ihre relativen Konzentrationsprofile. Es ist wichtig, das NMR-Rohr der Durchflusseinheit langsam und stetig einzusetzen und zu entfernen, um Drucksprünge zu vermeiden, die zur Bildung von Blasen führen können.
Die Entwicklung von NMR-Bioreaktoren hat den Weg geebnet, um zeitabhängige Prozesse mit atomarer Auflösung zu untersuchen, wie z.B. die Darstellung der Redux-Regulation und der Wechselwirkungen zwischen Medikament und Ziel in lebenden Zellen.
