Diese Methode nutzt die verschiedenen Möglichkeiten, um die rekombinanten viralen Proteinexpressionsherausforderungen mit einem viralen Protein P'as Chaperon für ein anderes virales Protein N'zu bewältigen, um RNA-freie N-Proteine zu erhalten. Das RNA-freie RSV-N-Protein wird erhalten, bevor die virusspezifische RNA in vitro zu Nukleokapsid zusammengesetzt wird. Die Methode kann auch mit anderen nicht segmentierten RNA-Viren mit negativem Sinn verwendet werden.
Die ligationsunabhängige Klonmethode ist eine schnelle Technik zum Erwerb von Co-Expressionskonstrukten. Warum oder Wahlfächer Fleckelektronenmikroskop ist eine schnelle Methode zur Überprüfung großer Assemble in Rohzellen. Wir möchten Ihnen zwei Tipps geben.
Erhalten Sie zunächst eine hohe Ausbeute und solide Ergebnisse für jeden Schritt, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Zweitens, richten Sie geeignete Programme für die Chromatographie ein und üben Sie, Gitter mit einer Zette aufzunehmen. Für die bi-cistronische Konstruktion der N- und P-Koexpression werden vier Ein-Liter-Kulturen von E coli BL21DE3-Stammzellen in LB-Medium bei 37 Grad Celsius züchtet.
Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern 0,6 erreicht, senken Sie die Temperatur auf 16 Grad Celsius. Nach einer Stunde Proteinexpression durch Behandlung mit 0,5 Millimolar IPTG über Nacht induzieren. Am nächsten Morgen sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren die Pellets in 200 Milliliter Lysepuffer.
Lyse der Zellen durch Beschallung für 15 Minuten, mit drei Sekunden an, drei Sekunden aus Impulsen. Und sammeln Sie die Lysate durch Zentrifugation. Laden Sie den Überstand in eine 2,5 x 10 Zentimeter große Kobalt-Schwerkraftsäule mit etwa 10 Millilitern Perlen.
Vorgleichgewichtig mit 5 bis 10 Säulenvolumina Lysepuffer. Und waschen Sie die Säule mit fünf Säulenvolumina Puffer B und fünf Volumina Puffer C.Verwenden Sie zwei Volumen Puffer D, um das Protein aus den Perlen zu eluieren. Und gleicht die Q-Spalte mit fünf einem Milliliter Volumen QA-Puffer aus.
Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um die verdünnte Probe auf die Säule zu laden. Schmelzen Sie die geladene Q-Säule zusammen mit frischen QA- und QB-Puffern auf die HPLC-Maschine. Führen Sie die Pumpenwäsche aus, um die Maschine erfolgreich mit ein bis zwei Volumen QB- und QA-Puffern zu waschen.
Stellen Sie nach der letzten Wäsche die Durchflussrate auf einen Milliliter pro Minute ein und stellen Sie UV1 auf 280 Nanometer und UV2 auf 260 Nanometer ein, wobei Sie eine 96-Tiefenbrunnenplatte verwenden, um die Fraktionen zu sammeln. Verwenden Sie dann eine schrittweise Gradientenapplikation von drei bis vier Volumina jeder Konzentration des Elutionsmittels, um die Proteine zu eluieren, beginnend bei einer QB-Konzentration von 0% und erhöhen Sie den Prozentsatz jedes Mal um 5%. Der N-0 P-Proteinkomplex eluiert bei der 15%igen QB-Pufferkonzentration.
Isolieren Sie das Protein durch Gelfiltration in einer ein mal 30 Zentimeter kleinen Reinigungssäule, die mit Puffer E ausgeglichen ist.Analysieren Sie dann die proteinhaltigen Fraktionen nach SDS-Seite. Für die virusspezifische Nukleokapsidanordnung mischen und inkubieren Sie den gereinigten N-0 P-Komplex mit RNA-Oligo im Verhältnis 1:1,5 Molekül bei Raumtemperatur für eine Stunde. Vorgleichung einer kleinen Reinigungsgelfiltrationssäule mit Puffer E. Und Entfernen Sie alle Fällungen durch Zentrifugation.
Laden Sie den Überstand in die Größenausschlusschromatographiesäule. Und vergleichen Sie die Größenausschlusschromatographiebilder des Proteins mit der RNA-Assemblierung und den Protein-allein-Kontrollproben, indem sie die Nukleinsäure-Reinheitsverhältnisse kombinieren, um zu identifizieren, welche Peaks die zusammengesetzte N-RNA, N-0 P und freie RNA sind. Um einen N-RNA-Komplex zusammenzustellen, sammeln Sie alle N-RNA-Peak-Fraktionen, führen Sie eine RNA-Extraktion durch und führen Sie ein Harnstoff-Seitengel aus, um die Länge der spezifischen RNA zu überprüfen.
Um ein negatives Fleckengitter für die negative Fleckenelektronenmikroskopie vorzubereiten, verwenden Sie eine Wärmeplatte, um 5 ml doppelt destilliertes Wasser zum Kochen zu erhitzen, und fügen Sie dem Wasser 37,5 Milligramm Uranylformiat hinzu, um eine 0,75% Uranylformiat-Färbelösung zu erhalten. Geben Sie die Lösung in ein mit Aluminiumfolie überzogenes Becherglas. Und fügen Sie vier Mikroliter von 10 molaren Natriumhydroxid hinzu.
Nach 15 Minuten vor Licht geschütztem Rühren die Lösung durch einen 0,22-Mikron-Filter in ein Reagenzglas filtrieren. Um die kontinuierlichen kohlenstoffbeschichteten Elektronenmikroskopiegitter hydrophil zu machen, legen Sie die Gitter in eine Kammer, die an eine Stromversorgung angeschlossen ist, und wenden Negativ geladene Ionen auf die Gitter an. Schneiden und falten Sie einen zwei mal zwei Zoll großen Parafilmstreifen.
Fügen Sie zwei 40-Mikroliter-Tropfen destilliertes Wasser an ein Ende des Streifens hinzu. Und zwei 40-Mikroliter-Tropfen mit 0,75% Uranylformiat-Färbelösung am anderen Ende. Fügen Sie drei Mikroliter Proteinprobe zu jedem Gitter hinzu.
Nach einer Minute die Gitter gegen Löschpapier blockieren und die Gitter zweimal in die destillierten Wassertröpfchen tauchen. Und einmal in der ersten Färbelösung Tröpfchen. Tauchen Sie dann das Gitter für 30 Sekunden in das zweite Färbelösungströpfchen, bevor Sie die Gitter gegen Löschpapier löschen, um überschüssige Fleckenlösung zu entfernen und die Gitter vor der Bildgebung an der Luft trocknen zu lassen.
Mit diesem Protokoll kann ein großräumiger löslicher heterodimerer respiratorischer Synzytialvirus-N0-P-Komplex erhalten werden. In E coli wird die gesamte Länge der N- und N-terminalen Teile der P-Proteine mit einem 10 X His-Tag auf dem N-Protein co-exprimiert. Basierend auf dem Nukleinsäurereinheitsverhältnis der UV-Absorption enthielt N0 P sowohl das N- als auch das N-terminale P in voller Länge, enthielt jedoch keine zelluläre RNA.
Das gereinigte N0 P konnte dann stimuliert und zu Nukleokapsid-ähnlichen Partikeln auf elektronenmikroskopischen Gittern durch Inkubation mit spezifischen RNA-Oligos zusammengesetzt werden, wie gezeigt. Vermeiden Sie bei der Reinigung des Proteins Luftblasen während der Säulenreinigung und verdünnen Sie die Probe mit QA-Puffer, um den pH-Wert und die Salzkonzentration einzustellen, bevor Sie die Probe auf die Säule laden. Achten Sie darauf, die Elektronenmikroskopiegitter am äußeren Rand zu halten, um eine Kontamination der Gitter zu vermeiden.
Dies wird uns helfen, die nicht-positiven RSV-Genompackungsfragen zu bestimmen, unabhängig davon, ob es sich um eine linkshändige oder rechtshändige helikale Struktur handelt. Nach diesen Verfahren und authentisch kann eine RNA-Vorlage für den RSV-Polymerase-Aktivitätsassay durchgeführt werden. Und dieses RSV-virusspezifische Nukleokapsid kann für die hochauflösende Kryo-EM-Analyse verwendet werden.
