Mikroumgebungen ermöglichen eine hochkomplexe und dynamische Umgebung, einschließlich sich ständig verändernder Zytokine, Ligandenkonzentration und Zusammensetzung. Die Schaffung einer ähnlichen Kulturumgebung ist entscheidend für In-vitro-Studien an komplexen Lebensmaschinen wie Stammzelldifferenzierung, Immunantworten und die Entwicklung von Organen auf Chipplattformen. Aber chemische Signale von NanoliterVolumen und MillisekundenGenauigkeit zu erzeugen und zu liefern, ist mit herkömmlichen biomedizinischen Ansätzen wie Pipettierung schwierig.
Um den Herausforderungen gerecht zu werden, ist eine Kulturplattform, die in der Lage ist, die Erzeugung dynamischer kombinatorialer und sequentieller Signaleingaben abwechselnd zu erhalten, sehr gefragt. In diesem Protokoll werden das Design- und Herstellungsverfahren eines mikrofluidischen Geräts vorgestellt. Der vorgeschlagene mikrofluidische Chip besteht aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter peristaltischer Pumpen und einem Mischmodul vor Ort.
Wir zeigen, dass die Plattform für Studien an einzelligen zweidimensionalen Zellpopulationen und dreidimensionalen neuronalen Sphären geeignet ist. Die komplexen und dynamischen Umgebungsbedingungen auf Chip haben große Auswirkungen auf die Differenzierung neuronaler Stammzellen und die Selbsterneuerung. Die Details der Design- und Herstellungsverfahren sind wie folgt.
Das Chipdesign wurde mit AutoCAD-Software durchgeführt. Um die Größe des Plattenhalters auf dem Mikroskop anzupassen, ist der mikrofluidische Chip etwa sieben mal fünf Zentimeter groß und besteht aus 1.500 Kulturkammern. Eines der wichtigsten Merkmale ist es peristaltische Pumpe, die aus acht Strömungskanälen und 200 Mikrometer breite Steuerkanäle besteht.
Die Zunahme des überlappenden Bereichs zwischen Steuerung und Durchflusskanal erhöht sich im Vergleich zur peristaltischen Pumpe, die Stephen Quake 2002 vorgeschlagen hat, auf etwa 15 Nanoliter Flüssigkeit und pro Pumpzyklus und reicht aus, um 1.500 unabhängige Umgebungsbedingungen parallel auf dem Chip aufrechtzuerhalten. Ein weiterer wichtiger Teil des Geräts ist eine zweischichtige Kulturkammer, die eine scherfreie Kulturumgebung erhalten kann. Die unerwünschte Scherspannung wird verhindert, indem sie schnell durch die obere Schicht geleitet wird.
Die Zellen, Gewebe und das entscheidende konditionelle Medium bleiben an der unteren Schicht unberührt. Numerische Simulation enden darauf, dass, wenn die Flüssigkeiten durch Kulturkammern gerichtet werden, von links nach rechts. die Scherkräfte können effektiv verhindert werden.
Selbst bei einer Eingangsdurchflussrate von 10 Millimetern pro Sekunde bleiben Zelle oder mikrometergroßes Gewebe am unteren Rand der Kultureinheit ungestört. Wir fertigten den Replikform- oder Siliziumwafer mit UV-Lithographie. Die Fluidkanäle von 25 Mikrometern Höhe und 100 Mikrometern Gewicht werden mit SU-8 3025 negativem Photoresist hergestellt.
Die Kulturkammern von 75 Mikrometern und 150 Mikrometern Höhe wurden mit SU-8 3075 photoresist hergestellt. DER AZ50X positive Photoresist wird für die runden Brunnenmerkmale verwendet, die sich mit den Steuerkanälen überlappen, um eine gute Verbindung zu gewährleisten. Zur Herstellung des mikrofludischen Chips wurden die gemusterten und leeren Siliziumwafer zunächst mit TMCS behandelt.
Verschiedene Mengen von PDMS 10 bis 1 des Monomer-Katalysator-Verhältnisses wurden gründlich gemischt und für ein bis zwei Stunden in der Vakuumkammer bei minus 0,85 Megapascal debubbled. Die Kontrollschicht wurde durch Spinbeschichtung PDMS bei 2, 200 U/min erhalten. Die Siliziumwafer wurden dann in den Inkubator überführt und 60 Minuten lang bei 80 Grad Celsius inkubiert.
Verschiedene Schichten wurden mit einem kundenspezifischen optischen Gerät und einer Plasmaätzmaschine ausgerichtet und miteinander verbunden. Die Einlasslöcher wurden dann nach weiteren zwei Stunden thermischer Bindung bei 80 Grad Celsius geschlagen. Der Chip wurde mit einem PDMS-beschichteten Deckbelag verbunden, der die gleiche Größe wie 96-Well-Platte hat und vor Gebrauch mindestens 12 Stunden bei 80 Grad Celsius ausgehärtet wurde.
Für den Betrieb wurden Steuerkanäle über Kunststoffschläuche an miniaturpneumatische Magnetventile angeschlossen. Das Drehen aller penumatic Brunnen wurde durch ein benutzerdefiniertes MATLAB-Programm über die grafische Benutzeroberfläche gesteuert. Für jeden Chip wurden die optimalen Schließdrücke von Push-up-PDMS-Membranventilen individuell ermittelt, die in der Regel zwischen 25 und 30 PSI liegen.
Durch Drehen aller Brunnenserien können dynamisch kombinatorische und sequenzielle Eingänge auf Dem Chip generiert werden. Die Zellen wurden bei 80 % Konfluenz geerntet und mit dem Kulturmedium DMEM mit einer Dichte von etwa 10 bis zur Leistung von sechs Promille resuspendiert, die dann durch Druck auf die zellhaltige Lösung in den Chip geladen wurden. Sowohl für die Anhängs- als auch für die Suspensionskultur von Neurostammzellen wurden Zellen gesammelt und die Kugeln direkt in den Chip geladen.
Für die Bildaufnahme wurden ein invertiertes Mikroskop mit automatischer Translationsstufe und die digitale komplementäre Metalloxid-Halbleiterkamera eingesetzt. Die Bühnen- und Bildaufnahme wurde über die Software gesteuert, die die obere linke Ecke und die unteren rechten Eckkammern als Auswahlpunkte zeigt und die Übersetzungsstufe zu den Punkten geordnet bewegt, um die vorläufige Bildgebung mit 4x Objektiv zu erhalten. Ändern Sie die 4x Objektivlinse mit der 20x objektiven und passen Sie bildgebende Parameter einschließlich Lichtintensität, Zeit aussetzen, et cetera.
Dann lokalisieren Sie die Auswahlpunkte so, dass die Position jeder Kammer 13 mal 15 Kammermatrix verlässt oder automatisch vom Programm definiert wird. Mit der Bestimmung der Koordinaten der Kammern bewegt sich die Translationsstufe in jede Kammer, in der die X-, Y-, Z-Fokalebene fein abgestimmt werden kann. Legen Sie das Intervall und die Dauer des Bildgebungszyklus fest.
Speichern Sie den Pfad, und starten Sie dann mit der Bildgebung. Dieses System ist für verschiedene Ziel-Dynamische Tracking, wie neuronale Stammzellen Differenzierung im Hellfeld und das Fluoreszenzfeld des Prozesses der neuronalen Stammzellen Kugelbildung. Datenanalyse.
Ändern Sie das Format in nd2 in Tif mit dem benutzerdefinierten MATLAB-Programm. Und teilen Sie die Daten nach Punkten auf. Wählen Sie das zu analysierende Objekt ist Zelle oder Gewebe.
Geben Sie den Schwellenwert, die Objektgröße und die Rauschgröße ein, um sie zu analysieren. Oder Sie können eine Schritt-für-Schritt-Analyse nach optimalen Parametern wählen. Und dann alle Daten analysieren.
Nachdem Sie das Ergebnis im MAT-Format gespeichert haben, verwenden Sie das Diagramm, um die Ergebnisse oder Ablaufverfolgungen zu zeichnen. In diesem Beitrag haben wir das Protokoll der und Der Kultur des hochdurchsatzigen mikrofluidischen Chipsystems auf Basis der Photolithographie-Technologie für die dynamische Steuerung der Mikroumgebung von Lebendenzellen beschrieben. Wir beschrieben auch einige Parameter, die man sorgfältig kontrollieren sollte, wie den Schließdruck von PDMS-Membranventilen und die Spin-Steuerung von Flüssigkeit parallel zur Kammer.
In der traditionellen Zell-In-vitro-Kultur wird die Behandlung der Zellkultur-Umgebung manuell durchgeführt, was zeitaufwändig und mühsam und flüssigkeitsgefüllt ist nicht einfach zu Standard-Kontrolle durchgeführt. Besonders Minuten Lösung. Es gibt einige Probleme wie die Erzeugung von Inputs, Immundrogenkonzentration und großen Verbrauch.
Mit unserem mikrofluidischen System ist es jedoch möglich, es als Stimulator in einer festen Dosis Einzelflüssigkeit gleiche Menge an gleichmäßiger Konzentration zu wiederholen, verschiedene Kulturen in verschiedenen Kulturkammern zur gleichen Zeit zu vergleichen. Anders mit einigen Miniatur-Zeitlichen Auflösung zurück Stimulus und mit Untersetzen der Auflösung durch Regulierung der Flüssigkeit. Darüber hinaus kann unser System durch einfache Operationen eine große Anzahl vergleichender Experimenteller Ergebnisse erhalten.
Unser System basiert auf dem Prinzip der Diffusion, schafft minimale mechanische Störungen in der zellulären Mikroumgebung. Für stabilere zelluläre Mikroumgebungschips können Sie die Liste der Pufferschicht als Tiefe der Kulturschicht erhöhen oder die Eingangsflüssigkeit des mittleren Austauschs reduzieren, d. h. den Druck reduzieren, der hier für die Erforschung des Zellverhaltens sein wird. Es ist zu beachten, dass diese Studie nur die Kultur von 3T3- und NSC-Zellen untersucht hat.
Bei anderen Zellen oder Zelllinien sind die Kulturbedingungen vergleichbar mit unseren Parametern, um sie anzupassen.
