Diese Arbeit wurde vom Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/) unterstützt. Diese Forschung wurde teilweise mit der MX2-Beamline am Australian Synchrotron, einem Teil von ANSTO, durchgeführt und verwendet den Detektor der Australian Cancer Research Foundation (ACRF).

1. Herstellung von Kristallen in einem hochviskosen Medium mit Glasspritzen
<ol><li>Zentrifugieren Sie die Kristalllösung vorsichtig (ca. 1.000 x g, 10 min bei 22 °C), um ein weiches Kristallpellet zu bilden und den überschüssigen Puffer zu entfernen. Dies führt zu einer hohen Kristallkonzentration im Pellet, die für die Datenerfassung verwendet werden kann. HINWEIS: Um eine Verdünnung der viskosen Medien zu verhindern, erhöhen Sie die Kristallkonzentration in diesem Schritt. Optimieren Sie das Verhältnis von viskosen Medien zu Kristallvolumen für jede Probe, um eine hohe Kristallkonzentration zu erhalten und gleichzeitig eine hohe Viskosität für die Medien zu erhalten. Zentrifugieren Sie die Kristalllösung, um ein Pellet zu bilden und überschüssigepuffer zu entfernen, um die Kristallkonzentration in der Lösung zu erhöhen, wie in Darmanin et beschrieben. 29.</li>
	<li>Richten Sie zwei 100-L-Spritzen mit einem Koppler ein.</li>
	<li>Befestigen Sie den Koppler am Ende der ersten Spritze und fügen Sie der Oberseite der Spritze eine Kristalllösung mit 28 l. L hinzu. Legen Sie den Kolben langsam in die Oberseite der Spritze ein und drücken Sie die Lösung vorsichtig bis zum Ende der Kupplungsspitze, wodurch sich alle sich bildenden Luftblasen entfernen. Gehen Sie folgen Sie einer der beiden unten beschriebenen Methoden. HINWEIS: Das Volumen der Kristalle, die dem hochviskosen Medium zugesetzt werden sollen, kann variiert werden, wenn es die Viskosität der Gesamtprobe nicht wesentlich verändert.<ol>
<li>Erste Methode: Verwenden Sie schnelle Druckänderungen, um die Luftblasen zu platzen.<ol>
<li>Legen Sie vorsichtig einen Handfinger auf die Oberseite des stumpfen Kupplungsnadelpunkts und (sehr sanft) Druck ausüben, um eine Dichtung zu erzeugen. Wenden Sie nicht zu viel Druck auf, da dies zu einer Nadelstichverletzung führen kann.</li>
			<li>Ziehen Sie nun den Kolben zurück, um die Lösung vom Nadelpunkt wegzuziehen, dies erzeugt eine Anhäufung von Druck in der Spritze.</li>
			<li>Lösen Sie den Druck an der Oberseite der Spritze schnell, indem Sie den Gehandicapfinger von der abgestumpften Nadelspitze entfernen. Seien Sie vorsichtig, wenn die Probe zu nah an der Spitze ist, wenn der Finger entfernt wird, kann es sprayout, was zu einem Verlust der Probe. Die schnelle Druckänderung innerhalb der Spritze wird die Luftblasen platzen lassen. Wiederholen Sie dies, bis alle Blasen entfernt wurden.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zweite Methode: Verwendung der "menschlichen Zentrifuge" zur Entfernung von Luftblasen.<ol>
<li>Legen Sie die Spritze in eine Hand mit der Nachoben zeigenden Nadel und dem Kolben zwischen zwei Fingern, so dass sie sich nicht bewegen kann.</li>
			<li>Drehen Sie den Arm, der die Spritze in eine Richtung hält, 2-3 Mal schnell, die resultierende Zentrifugalkraft auf der Probe zwingt alle Luftblasen aus der Spritze. Seien Sie vorsichtig, wenn zu langsam durchgeführt Probe verloren gehen kann.</li>
			<li>Prüfen Sie die Spritze auf Luftblasen, wenn Blasen übrig bleiben, wiederholen Sie die Schritte 1.3.2.1 – 1.3.2.2, bis alle Luftblasen entfernt sind.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Mit einem feinen Spachtel geben Sie 42 L Hochvakuum-Silikonfett direkt an die Oberseite der zweiten Spritze. Drücken Sie den Kolben bis zum Ende, entfernen Sie alle Luftblasen und stellen Sie sicher, dass sich am Ende der Spritze kein Luftspalt befindet. HINWEIS: Die genaue Zusammensetzung des Silikonfetts ist nicht entscheidend, da es als inerter Träger wirkt. Ein Viskositätswert von >10 Pa.s oder ein Verhältnis von ca. 60:40 Silikonfett zu Kristalllösung ist optimal für die Injektion, es ist jedoch möglich, dass dies je nach den genauen Eigenschaften der Probe variieren kann. Passen Sie das Volumen der Kristalllösung, die dem Silikonfett zugesetzt wird, an, um die Kristallkonzentration in der Mischung zu optimieren, wie in der Diskussion beschrieben. Hochviskose Medien außer Silikonfett können verwendet werden, solange sie mit der Probe30,31,32,33kompatibel sind.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass sich in einer der beiden Spritzen keine Luftblasen befinden, und befestigen Sie die Spritzen mit dem Koppler. Halten Sie die Spritzen vertikal, indem Sie nur das Ende der Spritze greifen, da das Aufwärmen der Spritze aufgrund der von den Fingern erzeugten Wärme die Probe beeinflussen kann.</li>
	<li>Mischen Sie die Probe, indem Sie den Kolben auf der Kristalllösungsseite sanft deprimieren, so dass er sich in das Silikonfett mischt, und dann den Kolben auf die Silikonfettseite drücken, so dass er die Probe zurück zur Kristalllösungsseite schiebt. Wiederholen Sie diesen Vorgang 50 bis 100 Mal, so dass die Probe gründlich gemischt wird und homogenaussieht. HINWEIS: Wenn die Kristalle direkt in hochviskosen Medien (z. B. lipidische kubische Phase, LCP) angebaut werden, sind die Schritte 1.1–1.6 nicht erforderlich. Protokolle für den Anbau von Kristallen in den Spritzen finden sie in Liu et.al. 34,35. Folgen Sie diesem Protokoll bis zur Probenkonsolidierung, Schritt 10, wo die gesamte Probe nun in einer Spritze enthalten ist und der Kristallisationspuffer entfernt wird. Die Hinzufügung von 7.9MAG ist für dieses Protokoll nicht erforderlich. Entfernen Sie stattdessen alle überschüssigen Flüssigkeiten aus der Spritze, indem Sie den Kolben in der Probe vorsichtig nach unten drücken, bis keine Flüssigkeit mehr in der Spritze verbleibt.</li>
	<li>Visualisieren Sie die Kristalle unter einem optischen Mikroskop entweder durch die Spritze oder extrahieren Sie, um optimale Ergebnisse zu erzielen, eine kleine Menge (ca. 1 L) auf ein Glasschlitten und legen Sie einen Deckelzettel auf die Oberseite.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Kristallkonzentration.<ol>
<li>Bestimmen Sie die Kristallkonzentration im Silikonfett, indem Sie die Anzahl der Kristalle in einem bestimmten Bereich mithilfe der optischen Mikroskopbilder zählen. Für beste Ergebnisse ist eine hohe Dichte von Kristallen, die gleichmäßig in den Medien verteilt werden, ideal (>106 Kristalle/ml), um eine hohe Kristalltrefferrate zu erhalten.</li>
		<li>Passen Sie die Kristallkonzentration in der Spritze an, indem Sie das Verhältnis von Kristallen zu viskosen Medien in den Schritten 1.3 und 1.4 ändern.<ol>
<li>Um die Kristallkonzentration zu verringern, verdünnen Sie die Kristalle in der Spritze, indem Sie die Menge an Silikonfett/HV-Medien bei Schritt 1.4 erhöhen oder indem Sie das Kristallpellet in Lösung mit dem Kristallisationspuffer verdünnen, bevor sie die Spritzen in Schritt 1.1 aufstellen.</li>
			<li>Um die Kristallkonzentration zu erhöhen, verringern Sie die Menge an Silikonfett in Schritt 1.4, aber achten Sie darauf, die Viskosität nicht unter 10 Pa.s zu reduzieren. HINWEIS: Die hier gemeldete Kristallkonzentration wurde für diese spezifische Probe und Kristallgröße optimiert. Die ideale Kristallkonzentration hängt jedoch von der Kristallgröße, der Strahlgröße, dem Nadelinnendurchmesser (I.D.) und dem einfallenden Röntgenfluss ab. Dies kann anhand der Trefferquote mit einer optimalen Trefferquote von 30 % als "gut" ermittelt werden. In der Praxis muss die Kristallkonzentration für verschiedene Proben während der Strahlzeit optimiert werden, um die gewünschte Trefferrate zu erhalten. Beginnen Sie mit einer hohen Kristallkonzentration, 109 Kristallen/ml. Das Verfahren zur Einstellung der Kristallkonzentration ist in Liu et.al angegeben. 35.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Das Protokoll kann hier angehalten werden, bis der Injektor für die Datenerfassung bereit ist.<ol>
<li>Wenn die Kristalle in LCP angebaut werden, dann versiegeln Sie sie und lassen Sie sie in Spritzen für bis zu ein paar Tage bei Raumtemperatur bleiben.</li>
			<li>Wenn die Kristalle auf ein anderes hochviskoses Medium (z. B. Silikonfett) übertragen wurden, sollte vor der Messung ein Stabilitätstest der Kristalle im Laufe der Zeit durchgeführt werden. Dadurch wird bestimmt, wie lange die Kristalle in den inerten Medien stabil sind (idealerweise > 8 h) und das Zeitlimit für die Datenerfassung. Hier waren Lysozymkristalle tagelang stabil in Silikonfett und zeigten bei der Inspektion mit einem optischen Mikroskop keine Anzeichen einer Auflösung.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Bewegen Sie die gesamte Probe in eine Spritze, bevor Sie den Koppler trennen. Trennen Sie den Koppler von der Spritze und befestigen Sie die Injektionsnadel. Schrauben Sie die Nadel fest in die Basis der Spritze und stellen Sie sicher, dass sie fest befestigt ist, um Leckagen zu vermeiden. Für dieses Experiment wurde eine Nadel aus 108 m I.D. (Nadellänge 13 mm, Punktstil 3) verwendet. Befestigen Sie je nach Kristallgröße und Strahlgröße entweder eine 51-m- oder eine 108-m-I.D.-Nadel. HINWEIS: Eine Vorprüfung des Probenstroms vor dem Abstrahlen ist erforderlich, um die richtige Injektornadelgröße auswählen zu können. Abhängig von den Probeneigenschaften (d. h. Viskosität, Aufladung, Pufferzusammensetzung) und der Nadel I.D. fließen die Proben unterschiedlich. Daher wird empfohlen, eine Vielzahl von Nadelgrößen zu testen, um den stabilsten Strom mit der kleinstmöglichen I.D.-Nadel zu erzeugen, um das Signal-Rausch-Verhältnis während der Datenerfassung zu maximieren.</li>
	<li>Wenn der Injektor bereits montiert und an der Strahllinie ausgerichtet ist, bewegen Sie sich zu Abschnitt 3 und montieren Sie die Probenspritze direkt auf den Injektor. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
</ol>2. Injektormontage und -steuerung
<ol><li>Montieren Sie den Injektor auf die Beamline. Entfernen Sie die kryogene Düse an der MX2-Beamline und ersetzen Sie sie durch den Injektor. Lösen Sie die Spannschraube, die die kryogene Düse hält, und befestigen Sie sie an der Halterung neben der motorisierten Stufe.</li>
	<li>Heben Sie den Injektor aus seinem Wagen, indem Sie den schwarzen Griff halten und auf die motorisierte Bühne stellen.<ol>
<li>Zur Befestigung des Injektors an der motorisierten Stufe; Hand den schwarzen Spannschraubenknopf anziehen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montieren Sie eine leere Spritze auf den Injektor<ol>
<li>Wählen Sie in der Injektor-Computersteuerungsschnittstelle (d.h. EPOS-Positionssteuerungssoftware) im Softwaremenü homing Mode unter Extras aus. Wählen Sie dann Negative Endschalter und Starten Sie Homing, lassen Sie die Software laufen, bis die Schraube ausreichend eingefahren ist, damit die Spritze unter die Schraube passt. Wenn der Endschalter unbeaufsichtigt läuft, stoppt er die Schraube automatisch.</li>
		<li>Montieren Sie eine leere ('dummy') Spritze auf den Injektor, indem Sie die Nadel durch den Schlitz in den Spritzenhalter einlegen. Richten Sie die Spritze gegen die Halterung aus.</li>
		<li>Befestigen Sie die Spritze mit zwei O-Ringen.<ol>
<li>Wickeln Sie den ersten O-Ring über den mittleren Teil der Spritze, der ihn an den Haken auf beiden Seiten der Spritze befestigt.</li>
			<li>Schleifen Sie den zweiten O-Ring um die Haken am oberen Teil der Spritze und legen Sie dann einen Teil des O-Rings auf die Oberseite der Glasspritze, wie in der Demonstration und Abbildung 1Bgezeigt.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ausrichten des Injektors an Röntgenstrahl<ol>
<li>Bewegen Sie die motorisierte Bühne mit dem Injektor über die Beamline-Steuerungssoftware zum Röntgen-Interaktionspunkt. Dies kann mit der Inline-Kamera visualisiert werden. Die Größe und Position des Trägers wird durch ein rotes Kreuz auf dem Bildschirm bezeichnet und die motorisierte Bühne kann bewegt werden, um die Nadel am Röntgen-Interaktionsbereich auszurichten.</li>
		<li>Passen Sie die x- und y-Position der Bühne an, um die Nadel am roten Kreuz auszurichten.</li>
		<li>Passen Sie die z-Position an, bis die Nadelspitze in den Fokus rückt.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Ausrichtung der Nadelspitze und des Röntgenstrahls visuell, indem Sie überprüfen, ob die Spritzenspitze den Fadenkreuzen entspricht, die in dem optischen Mikroskopbild der Beamline-Kamera sichtbar sind.</li>
		<li>Sobald die Nadelspitze ausgerichtet ist, bewegen Sie die Spitze über den Querhaaren von 100 m. Dadurch entfällt die Röntgenstreuung von der Nadelspitze. HINWEIS: Das Anbringen und Ausrichten des Injektors an der MX2-Beamline am Synchrotron muss von den Beamline-Wissenschaftlern durchgeführt werden und kann in weniger als 30 min abgeschlossen werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Montage der Probenspritze
<ol><li>Ersetzen Sie die leere Spritze durch die Probenspritze, indem Sie Schritt 2.3 folgen.</li>
	<li>Legen Sie die Injektorkappe auf den Probenspritzenkolbenkopf.</li>
	<li>Bewegen Sie die Antriebsschraube an die Oberseite der Kappe.</li>
	<li>Wählen Sie in der Injektorsteuerungssoftware Velocity Modeaus.</li>
	<li>Geben Sie 3000 rpm (ca. 115 nL/s) als Einstellungswert ein und drücken Sie Einstellungswert anwenden.</li>
	<li>Wenn die Antriebsschraube die Kappe am Spritzenkolbenkopf berührt, stoppen Sie den Motor.<ol>
<li>Legen Sie den Drehzahlwert in der Injektorsteuerungssoftware auf Null fest, indem Sie den Einstellungswert auf '0' ändern, wenn sich die Schraube der Kappe nähert.</li>
		<li>Sobald der Kontakt hergestellt ist, aktivieren Sie den voreingestellten Wert, indem Sie den Einstellungswert anwenden drücken, um die Schraube sofort zu stoppen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wackeln Sie vorsichtig die Kappe, um sicherzustellen, dass sie fest an Ort und Stelle gehalten wird. HINWEIS: Wenn ein neuer Sollwert in das Feld Einstellungswert in der Steuerungssoftware eingegeben wird, wird er erst aktiviert, nachdem Sie den Einstellungswert anwendengedrückt haben.</li>
</ol>4. Ausführen des Injektors
<ol><li>Nachdem die Kappenantriebsschraube festen Kontakt mit der Oberseite des Kolbens hergestellt hat, ändern Sie den Drehzahlwert auf 100. Dies entspricht 4 nL/s.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Nadelspitze visuell, wenn die Probe zum ersten Mal herauskommt, oder betrachten Sie das Strahllinienkamerabild der Nadel, um zu beobachten, wann die Probe beginnt, von der Nadelspitze zu extrudieren.</li>
	<li>Führen Sie eine Suche nach der Hütte durch, schließen Sie die Hüttentür und schalten Sie den Röntgenstrahl ein. Von diesem Punkt aus muss der Injektor fernvon außerhalb der Hütte betrieben werden.</li>
	<li>Tune die Drehzahl, bis ein stabiler Stream generiert wird.<ol>
<li>Verringern Sie den Drehzahlwert auf 90.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 4.4.1, indem Sie den Drehzahlwert in Schritten von 10 verringern, um den Stream zu verlangsamen, aber dennoch einen stabilen Stream beizubehalten. Für Silikonfett wurde ein Wert von 30 Umdrehungen pro Minute verwendet. HINWEIS: Der typische Drehzahlbereich variiert je nach Probenmerkmalen und Röntgenbelichtungszeit zwischen 30 – 100 Rprossen (1 – 4 nL/s). Im Allgemeinen sollte die Drehzahl so abgestimmt werden, dass die langsamste Durchflussmenge erzeugt wird (um den Probenverbrauch zu minimieren) und gleichzeitig einen stabilen Strom aufrecht erhält.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwalten eines Beispielstreams, der nicht gut fließt.<ol>
<li>Erhöhen Sie den Drehzahlwert in Schritten von 10, bis der Stream geradlinig wird. Wenn sich der Stream nicht stabilisiert, versuchen Sie auch nach der Erhöhung des Drehzahlwerts auf den maximal enthoben Wert von 100 U/min, die Stabilität zu verbessern, indem Sie eine der beiden unten beschriebenen Methoden implementieren.<ol>
<li>Erste Methode: Fügen Sie einen Polystyrol-Probenfänger unter den Probenstrom ein, um die Probe zu führen. Diese Methode eignet sich gut für hoch geladene Sample-Streams.</li>
			<li>Zweite Methode: Legen Sie einen Venturi-Saugtrichter in den Probenfänger ein. Um den Trichter mit Luft zu versorgen, schließen Sie ihn an das Luftaustrittsrohr in der Hütte an. Diese Methode kann bei der Direktenundenstabilisierung des Probenflusses unabhängig von der Ladung des Stroms helfen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald ein konstanter und stetiger Strom erreicht ist, starten Sie die Datenerfassung und optimieren Sie den Detektorabstand gemäß einem normalen Röntgenkristallographieexperiment. HINWEIS: Die Drehzahl wird mithilfe der mitgelieferten Konvertierungstabelle in der Zusatzinformation "Lipidico Device Calculator" in die Durchflussrate konvertiert. Geben Sie den Drehzahlwert, die Nadeldurchmesser und das Spritzenvolumen ein, um den Durchfluss mit diesem Rechner zu berechnen.</li>
</ol>

<ol>
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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+delivery+using+viscous+media,+a+syringe+andasyringe+pump+for+serial+crystallography.">Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).</li><li>Shimazu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-viscosity+sample-injection+device+for+serial+femtosecond+crystallography+at+atmospheric+pressure.">High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).</li><li>Kovacsova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscous+hydrophilic+injection+matrices+for+serial+crystallography.">Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography.</a> International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).</li><li>Darmanin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystal+screening+and+characterization+for+serial+femtosecond+nanocrystallography.">Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography.</a> Scientific Reports. 6, 25345 (2016).</li><li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography.">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography.">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).</li><li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oil-free+hyaluronic+acid+matrix+for+serial+femtosecond+crystallography.">Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 6, 24484 (2016).</li><li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase.">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).</li><li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography.">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54463 (2016).</li><li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography.">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li><li>Hadian-Jazi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+peak-finding+algorithm+based+on+robust+statistical+analysis+in+serial+crystallography.">A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).</li><li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science:+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art.">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li></ol>

MK arbeitet für Kusel Designs. Kusel Design, ein kundenspezifischer Laborgeräteentwickler, wurde von Dr. Peter Bentsen von der La Trobe University und Dr. Tom Caradoc-Davies von ANSTO engagiert und entwickelte ein kostengünstiges Gerät, um hochviskose Studien in der MX2-Strahllinie am australischen Synchrotron zu ermöglichen. Das Gerät wurde in enger Abstimmung mit Dr. Caradoc-Davies entwickelt. Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Es wurde eine alternative HVI entwickelt, ideal für die Durchführung von SX-Experimenten an Synchrotronquellen. Es hat zwei wesentliche Vorteile gegenüber bestehenden HVIs. Erstens ist es einfach, auf der Beamline zu installieren, so dass schnelles Umschalten zwischen konventioneller Kristallographie und SX ermöglicht wird, nur 30 Minuten sind für die Installation und Ausrichtung auf MX2 erforderlich. Zweitens können die Probenspritzen, die zum Anbau von Kristallen verwendet werden, direkt als Injektionsreservoirs verwendet werden, wodurch die Verschwendung während des Probentransfers begrenzt wird. Das Protokoll zum Ändern von Proben wurde beschrieben und demonstriert. Das Design macht einen komplizierten Gasstrom überflüssig, um den Jet im Vergleich zu anderen HVIs zu steuern. Es wurde ein einfacher Prozess zur Änderung der Durchflussmenge des Injektors demonstriert, der ohne verzögerte Reaktion eingestellt werden kann.
Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche SX-Datenerfassung sind die Optimierung der Kristallkonzentration, die Erzielung einer homogenen Mischung aus hochviskosen Medien und die Erzeugung eines stabilen Datenstroms. Die optimale Kristallkonzentration und Homogenität kann erreicht werden, indem die Kristalle auf ein Pellet zentrifugiert und den Trägermedien eine höhere Kristallkonzentration hinzugefügt werden, wodurch sichergestellt wird, dass die Probe im Kupplungssystem gründlich gemischt wird. Sobald die Kristallkonzentration optimiert ist, kann die Injektordurchflussrate während der Strahlzeit leicht eingestellt werden, um einen stabilen Strom zu erhalten. Das Curling des viskosen Stroms wird häufig bei hochviskosen Proben beobachtet. Zwei Lösungen werden vorgestellt: die Verwendung eines Polystyrol-Probenfängers für geladene Proben oder die Zugabe eines Venturi-Saugtrichters, der als Catcher fungiert. Dies war bei der Kontrolle des Stroms in den ersten Tests erfolgreich, aber unter verschiedenen Probenbedingungen kann das Curling des Stroms dazu führen, dass die Probe an den Nadelpunkt klebt. Es ist möglich, dass dies durch Veränderung der Oberflächenladungseigenschaften der Nadel durch Hinzufügen spezieller Beschichtungen überwunden werden könnte. Mit verschiedenen Chemikalien beschichtete Nadeln (z.B. Silikon) wurden bisher erfolgreich für den Einsatz mit Flüssigkeitshandhabungsrobotern adaptiert und können kundenspezifisch nach Derinze37bestellt werden.
Der Injektor ist nicht auf Silikonfett beschränkt und kann mit anderen hochviskosen Flüssigkeiten verwendet werden. Es wurden mehrere verschiedene Alternativen gezeigt23, die erfolgreich für die Kristallinjektion verwendet werden können und in einer Reihe von anderen Publikationen22,30,33beschrieben werden. Die obere Grenze für die Probenviskosität mit diesem HVI wird noch untersucht, jedoch haben Probenviskositäten von bis zu 25 Pa.s (mit 100 % Silikonfett) zu einem stabilen Strom geführt. Wenn jedoch die Probenviskosität auf <10 Pa.s (mit 70 % Silikonfettprobe) reduziert wurde, konnte kein zuverlässiger Strom erzeugt werden. Daher stellt 10 Pa.s die aktuelle Untergrenze für die Probenviskosität für die Injektion mit diesem HVI dar. Die Nadel I.D. ist auch eine wichtige Überlegung. Obwohl 51 m I.D. erfolgreich getestet wurden, während verschiedene Träger ohne Kristalle injiziert wurden, stört die Einführung von Kristallen den Probenfluss. Daher besteht je nach Größe, bei Kristallen, die in die Matrix eingeführt werden, eine viel höhere Wahrscheinlichkeit einer Verstopfung bei Verwendung der 51-m-I.D.-Nadel im Vergleich zur größeren Nadelgröße. Wenn eine Blockade auftritt, kann es zu einer kritischen Druckanhäufung kommen, bei anderen Injektoren kann dies zu Spritzenbrüchen führen. Das Design dieses HVI beinhaltet jedoch einen Sicherheitsmechanismus, bei dem die Antriebsmechanik vom Spritzenkolben abzieht, wenn der Druck zu hoch wird, bis ein Deaktivierungsschalter aktiviert ist. Dies führt dazu, dass der Antrieb angehalten wird und verhindert, dass die Glasspritze zerbrach.
Für diesen Injektor gibt es mehrere Einschränkungen. Der Injektor ist speziell für hochviskose Proben konzipiert, daher können flüssigkeitsähnliche Proben nicht direkt für die Probenabgabe verwendet werden. Um diese Einschränkung zu überwinden, können Kristalle, die in Puffersystemen angebaut werden, mit einem geeigneten inerten Medium gemischt werden, wie in Schritt 1 beschrieben, es besteht jedoch die Möglichkeit, dass der Kristall instabil wird. Daher sollte zunächst das Screening einer Vielzahl von inerten Medien26,27,28,29 untersucht werden, um sicherzustellen, dass die Probenstabilität erhalten bleibt. Zweitens wirken sich die Größe des Kristalls und die Qualität der Kristallverpackung auf die Beugungsqualität aus. Die MX2-Beamline arbeitet mit einer optimalen Strahlgröße von 22 x 12 m (H x B) und einem Fluss von 1012 Photonen/s. Die optimale Kristallgröße für die Durchführung von SX bei MX2 beträgt 10 m und hat gezeigt, dass sie ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis liefert. Es ist jedoch möglich, Daten über kleinere Kristalle zu sammeln, wenn sie gut geordnet sind und auf hochauflösende Auflösung streuen. Es gibt eine Option, um die Strahlgröße an dieser Strahllinie auf 7,5 m zu verkleinern, jedoch hat dies seinen Preis, da es den Einfallsfluss reduziert, der während des Experiments berücksichtigt werden muss.
Die Entwicklung dieses Injektors macht SX für Mainstream-Kristallographen leicht zugänglich. Der erfolgreiche Betrieb von Lipidico öffnet die Tür zu einer schnellen und einfachen Methode für die SX-Datenerfassung an einer Vielzahl von Synchrotronquellen. Es ermöglicht die Raumtemperaturdatenerfassung von Kristallen, die bei MX2 10 m oder weniger sind, und begrenzt die Strahlungsschäden für einzelne Kristalle. Es bietet auch eine neue Gelegenheit in Australien, Millisekunden-Zeit gelöst SX durchzuführen, die der aktuelle Stand der Technik für Kristallographen ist. Zukünftige Anwendungen dieses Injektorsystems erstrecken sich auf die Röntgencharakterisierung hochviskoser Materialien mit Small Angle X-ray Scattering (SAXS), so dass der Injektor am australischen Synchrotron problemlos an andere Strahllinien angepasst werden kann.

Serielle Kristallographie (SX) ist eine Technik, die ursprünglich im Kontext von Röntgen-Freie-Elektronen-Laser (XFELs)1,2,3,4entwickelt wurde. Obwohl feste Zielansätze für SX5,6,7, in der Regel verwendet werden, um Kristalle in einem kontinuierlichen Strom an den Röntgenstrahl zu liefern. Da es Daten aus einer großen Anzahl von Kristallen kombiniert, vermeidet SX die Notwendigkeit einer Kristallausrichtung während des Experiments und ermöglicht die Erfassung von Daten bei Raumtemperatur8,9. Mit Hilfe eines geeigneten Injektors werden die Kristalle nacheinander in den Röntgen-Interaktionsbereich geströmt und die resultierenden Beugungsdaten auf einem Flächendetektor9,10gesammelt. Bis heute ist es SX gelungen, eine Reihe von Proteinstrukturen1,11,12,13 einschließlich Kristallen zu lösen, die zu klein sind, um sie mit konventioneller Kristallographie zu messen. Es hat auch neue Einblicke in die zeitaufgelöste molekulare Dynamik gegeben, indem es die Femtosekundenpulsdauer des XFEL ausnutzt. Durch die Initiierung von Pump-Sonden-Reaktionen mit optischen Laserquellen wurden eingehende Studien am Photosystem II14,15, photoaktivem gelben Protein16,17, Cytochrom C Oxidase18sowie Bakteriorhodopsin19,20,21durchgeführt. Diese Studien haben die Elektronentransferdynamik untersucht, die nach der Lichtaktivierung auftritt und das signifikante Potenzial der seriellen Kristallographie für das Verständnis zeitaufgelöster biologischer Prozesse demonstriert.
Die Entwicklung der seriellen Kristallographie wird auch an Synchrotronquellenimmerhäufiger 9,12,20,22,23,24. Synchrotron-basiertes SX ermöglicht es, eine große Anzahl einzelner Kristalle effizient bei Raumtemperatur mit einem geeigneten Injektorsystem zu messen. Dieser Ansatz eignet sich daher für kleinere Kristalle und erfordert nicht nur einen schnellen Framerate-Detektor, um die Daten zu erfassen, sondern auch einen mikrofokussierten Strahl. Im Vergleich zur konventionellen Kristallographie beinhaltet SX nicht die Montage und Ausrichtung einzelner Kristalle im Röntgenstrahl. Da Daten aus einer großen Anzahl einzelner Kristalle zusammengeführt werden, kann die von jedem Kristall empfangene Strahlendosis im Vergleich zur herkömmlichen Kristallographie erheblich reduziert werden. Synchrotron SX kann auch auf die Untersuchung von zeitaufgelösten Reaktionen angewendet werden, sogar bis zum Millisekundenregime, sofern ein Detektor mit einer ausreichend hohen Bildrate verfügbar ist (z. B. 100 Hz oder mehr). Mehrere serielle Kristallographie-Experimente wurden am Synchrotron mit Injektoren durchgeführt, die ursprünglich an XFEL-Quellen20,22,23entwickelt wurden. Die beiden häufigsten Arten von Injektoren sind die Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN)25 und High Viscous Injector (HVI)9,24,26,27,28. Der GDVN ist ideal für die Injektion von Flüssigkeitsproben mit niedriger Viskosität, erfordert jedoch hohe Durchflussraten, um stabile Ströme zu erzielen, was wiederum zu hohen Abtastraten führt. Im Gegensatz dazu eignen sich DIE HVI für Proben mit hoher Viskosität, die die Erzeugung eines stabilen Stroms bei wesentlich niedrigeren Durchflussraten ermöglichen, was zu einem wesentlich geringeren Probenverbrauch führt. Der HVI-Injektor bevorzugt daher die Abgabe von Proben, bei denen ein viskoser Träger vorzuziehen ist (z. B. Lipidbasis für Membranproteine) und/oder große Probenmengen nicht verfügbar sind. SX-Injektoren sind in der Regel eine Herausforderung zu bedienen und erfordern umfangreiche Schulungen, um zu arbeiten. Sie beinhalten auch langwierige Probenübertragungsprotokolle, da die Probe in ein spezielles Reservoir geladen werden muss, was im Allgemeinen ein hohes Risiko mit sich bringt, dass probenentweder im "toten Volumen" oder durch Leckagen in den Anschlüssen verloren gehen. Daher ist es wünschenswert, das Injektor-Design zu optimieren, um Verluste zu verringern, bevor die Probe den Röntgenstrahl erreicht.
Kürzlich wurden die ersten SX-Ergebnisse mit Lipidico23 mit einem Lysozym-Ziel mit einem Eiger 16M-Detektor veröffentlicht. Dieses Injektordesign begrenzt die Probenverschwendung, indem die Anzahl der Schritte minimiert wird, die mit der ersten Kristallisation zum Transfer von Kristallen in den Injektor verbunden sind, gefolgt von der Abgabe der Probe an den Röntgenstrahl. Dieses Manuskript beschreibt und demonstriert das Probentransferverfahren, beginnend mit der Probenvorbereitung, dem Übergang zum Injektionsprozess und schließlich der Datenerfassung unter Verwendung desselben Kristallisationsgefäßes. Die Funktionsweise des Injektors wird ebenfalls beschrieben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hen eggwhite lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicon grease</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Z273554-1EA</td>
			<td>Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector needle (108 &#181;m ID)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part No: 7803-05</td>
			<td>www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass gas-tight syringes, 100 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>part no: 7656-01</td>
			<td>Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCP syringe coupler</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>209526</td>
			<td>Syringe coupler to mix the samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidico injector</td>
			<td>La Trobe Univerity/ANSTO</td>
			<td></td>
			<td>This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipidico injection protocol for serial crystallography measurements at the australian synchrotron

Am australischen Synchrotron wurde eine Anlage zur Durchführung serieller Kristallographiemessungen entwickelt. Diese Anlage verfügt über einen speziell gebauten hochviskosen Injektor, Lipidico, als Teil der makromolekularen Kristallographie (MX2) Strahllinie, um eine große Anzahl von kleinen Kristallen bei Raumtemperatur zu messen. Ziel dieser Technik ist es, den Anbau/Transfer von Kristallen in Glasspritzen zu ermöglichen, die direkt im Injektor zur seriellen Kristallographiedatenerfassung verwendet werden können. Zu den Vorteilen dieses Injektors gehört die Fähigkeit, schnell auf Veränderungen der Durchflussrate ohne Unterbrechung des Stroms zu reagieren. Für diesen Hochviskositätsinjektor (HVI) bestehen mehrere Einschränkungen, die eine Beschränkung der zulässigen Probenviskosität auf >10 Pa.s beinhalten. Die Streamstabilität kann je nach den spezifischen Eigenschaften der Stichprobe möglicherweise auch ein Problem darstellen. Ein detailliertes Protokoll zur Einrichtung von Proben und zum Betrieb des Injektors für serielle Kristallographiemessungen am australischen Synchrotron wird hier vorgestellt. Das Verfahren demonstriert die Vorbereitung der Probe, einschließlich der Übertragung von Lysozymkristallen in ein hochviskoses Medium (Silikonfett) und den Betrieb des Injektors zur Datenerfassung bei MX2.

Lipidico ist ein HVI, das als alternatives Liefersystem für den Einsatz auf MX2 gebaut wurde (Abbildung 1). Es ist ideal für SX geeignet, wo Kristalle entweder in lipidischer kubischer Phase angebaut oder auf ein hochviskoses inertes Medium übertragen werden.
Um die Injektoranwendung zu demonstrieren, wurde Silikonfett, das mit Lysozymkristallen gemischt wurde, verwendet, um SX-Daten an der MX2-Beamline am australischen Synchrotron zu sammeln. Um den Injektor an der MX2-Beamline zu montieren, wird die kryogene Düse entfernt und durch den Injektor ersetzt, wie in Abbildung 1dargestellt. Die Spritzenproben werden direkt am Injektor montiert und mit O-Ringen befestigt (Abbildung 1B). Die Datenerfassung kann innerhalb von Minuten nach einer Beispieländerung initiiert werden. Der Injektor ist für die schnelle Probensteuerung mit einem einfachen Setup konzipiert, das für Benutzer, die mit SX nicht vertraut sind, einfach zu bedienen ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61650/61650fig1v3.jpg"> Abbildung 1: Bilder von Lipidico, einem viskosen Injektor, das am australischen Synchrotron für SX-Experimente verwendet wird. (A) Zeigt ein Foto von Lipidico, das in MX2 integriert ist. Der rote Pfeil zeigt die Richtung des Röntgenstrahls an. (B) Ein genauerer Blick auf den Probenhalterbereich auf Lipidico. Die Spritze wird von zwei O-Ringen an Ort und Stelle gehalten und die Probe wird im Fänger gesammelt. (D) Eine Nahansicht des Probenstroms mit der Injektornadel und dem Probenabfallfänger, der so verändert werden kann, dass er einen Polystyrol-/Venturi-Saugfänger enthält, der unter der Nadel in (A )zu sehen ist. Die Figur wurde von Berntsen et adaptiert. 201923 mit Genehmigung von AIP Publishing. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61650/61650fig1v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Der Injektor ist mit verschiedenen Arten von hochviskosen Trägern kompatibel. Die optimale Probenlaufgeschwindigkeit für den Injektor ist entscheidend für die Strömungsstabilität, zu langsam führt zu einem Curling-Effekt/Stream-Erweiterung und zu schnell führt zum Stream-Abbruch. Die optimale Geschwindigkeit variiert je nach verwendetm Trägersystem. Abbildung 2 und Abbildung 3 zeigen Silikonfett, das mit unterschiedlichen Injektorgeschwindigkeiten getestet wurde, und zeigen, wie das Streamverhalten variieren kann. Eine langsame Durchflussrate(Abbildung 2A, 2,3 nL/s) führt zur Ausdehnung des aus dem Injektor extrudierten Silikonfetts, während eine schnellere Durchflussrate(Abbildung 2C, 6,6 nL/s) einen dünneren Strom erzeugt. Das Curling des viskosen Medienstroms wurde regelmäßig beobachtet (Abbildung 3A). Um dieses Problem zu lösen, wurden zwei innovative Lösungen getestet: ein Polystyrolfänger und ein Venturi-Saugtrichter unter der Nadel. Der Polystyrolfänger führt eine schwache elektrostatische Kraft ein und eignet sich am besten bei hoch geladenen Proben, wie im Fall von Silikonfett (Abbildung 3B), während der Venturi-Saugtrichter hilft, den Strom unabhängig von der Probenladung vertikal zum Catcher nach unten zu führen. Je nach den Merkmalen der Probe kann jede Option erfolgreich verwendet werden.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61650/61650fig2v3.jpg"> Abbildung 2: Die Wirkung eines hohen viskosen Trägerstroms mit unterschiedlichen Injektorgeschwindigkeiten. 100% Silikonfett wurde mit unterschiedlichen Probengeschwindigkeiten getestet, um seine Fließeigenschaften zu bewerten. (A) . 2,3 nL/s (30 Rpm), (B) 3,5 nl/s (90 Rpm) und (C) 6,6 k/s (170 Rpm). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61650/61650fig2v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61650/61650fig3v3.jpg"> Abbildung 3: Streamverhalten von 100% Silikonfett, das das Curling der viskosen Medien demonstriert. (A) Curling-Effekt bei 2,3 nl/s (30 U/min) (B) Der Effekt der Zugabe des Polystyrolfängers zum Probenabfallhalter mit der Injektorgeschwindigkeit von 2,3 nL/s (30 U/min). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61650/61650fig3v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Es wurde eine Inglasspritze verwendet, die 26 L Lysozymkristalle (Kristallgröße 10 x 10 x 20 m) enthält, die in Silikonfett aufgehängt sind (Abbildung 4A). Lipidico erzeugte einen konstanten Probenstrom mit der 108-m-Nadel I.D., mit einer durchschnittlichen Durchflussrate von 1,14 nL/s (wobei der Motor auf 30 Rpm eingestellt ist). Ein Peak-Finding-Algorithmus36 wurde verwendet, um die Trefferrate zu bewerten, und eine ausreichende Datenmenge (insgesamt 224.200 Bilder) wurde innerhalb von 38 Minuten Datenerfassungszeit gesammelt, was den Aufbau von Strukturen ermöglichte (PDB-Code 6MQV). Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung der Datenerhebungsstatistiken und Abbildung 4B zeigt ein repräsentatives Bild der Elektronendichtekarte, die eine der Disulfidbindungen in der Lysozymstruktur20umgibt.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61650/61650fig4v3.jpg"> Abbildung 4: Lysozyme-Bilder. (A) Optische Bilder der Lysozymkristalle in Silikonfett. Ein kreuzpolarisiertes (40-faches Vergrößerungsbild) von Lysozymkristallen gemischt mit einem hochviskosen Medium, Silikonfett, abgebildet mit einem sichtbaren Lichtmikroskop. Die Größe der Kristalle liegt zwischen 15 und 20 m und (B) Ein repräsentatives Bild der Elektronendichtekarte (2Fo-Fc, 1" um die Disulfidbindungen von Lysozym. Die Figur wurde von Berntsen et adaptiert. 201923 mit Genehmigung von AIP Publishing. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61650/61650fig4v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Informationen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61650/200727%20lipidico%20drive%20calculator_v3.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> 
Tabelle 1: Zusammenfassungstabelle mit SX-Datenstatistiken von Lipidico. Lysozymkristalle wurden mit einem hochviskosen Medium, Silikonfett gemischt und durch den Röntgen-Interaktionsbereich der MX2-Beamline gestreamt. Dies ist eine Zusammenfassung der vollständigen Tabelle der Ergebnisse, die in Berntsen et veröffentlicht wurden. 23. Die Tabelle wird hier mit Genehmigung von AIP Publishing angepasst.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Datenstatistik</td>
			<td>Lipidico, MX2-Beamline</td>
		</tr>
<tr>
<td>Detektor</td>
			<td>Dectris EIGER X 16M,</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bildrate</td>
			<td>100hz</td>
		</tr>
<tr>
<td>Probendetektorabstand (mm)</td>
			<td>300</td>
		</tr>
<tr>
<td>Röntgenenergie (KeV)</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Strahlgröße (WxH)</td>
			<td>12x22</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nein. von Rahmen</td>
			<td>224200</td>
		</tr>
<tr>
<td>Trefferquote (%)</td>
			<td>2.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nein. von indizierten Rahmen</td>
			<td>4852</td>
		</tr>
<tr>
<td>Entschließung (B)</td>
			<td>17.74-1.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vollständigkeit</td>
			<td>99.44</td>
		</tr>
<tr>
<td>Weltraumgruppe</td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
<tr>
<td>Einheitszelle</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>a, b, c ()</td>
			<td>78.68, 78.68, 34.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>α, β, γ (°)</td>
			<td>90, 90, 90</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>5.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>Redundanz</td>
			<td>73.97</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2</td>
			<td>0.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>RArbeit/Rfrei</td>
			<td>0.18/0.26</td>
		</tr>
</tbody></table>

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Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie serielle Kristallographieproben für die Datenerfassung auf einem hochviskosen Injektor, Lipidico, vorbereitet werden, das kürzlich im australischen Synchrotron in Auftrag gegeben wurde.

Lipidico Injektionsprotokoll für serielle Kristallographiemessungen am australischen Synchrotron

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

lipidico-injection-protocol-for-serial-crystallography-measurements

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

3.2K Aufrufe.  La Trobe University, Melbourne, Australia, 3086. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie serielle Kristallographieproben für die Datenerfassung auf einem hochviskosen Injektor, Lipidico, vorbereitet werden, das kürzlich im australischen Synchrotron in Auftrag gegeben wurde.

Serie: Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

Zellbasierte Calcium-Assay für Mittel-bis High-Throughput-Screening von TRP-Kanal-Funktionen mit FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Forschung

Biotechnik

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Engineering Platform and Experimental Protocol for Design and Evaluation of a Neurally-controlled Powered Transfemoral Prosthesis

To enable intuitive operation of powered artificial legs, an interface between user and prosthesis that can recognize the user's movement intent is desired. A novel neural-machine interface (NMI) based on neuromuscular-mechanical fusion developed in our previous study has demonstrated a great potential to accurately identify the intended movement of transfemoral amputees. However, this interface has not yet been integrated with a powered prosthetic leg for true neural control. This study aimed to report (1) a flexible platform to implement and optimize neural control of powered lower limb prosthesis and (2) an experimental setup and protocol to evaluate neural prosthesis control on patients with lower limb amputations. First a platform based on a PC and a visual programming environment were developed to implement the prosthesis control algorithms, including NMI training algorithm, NMI online testing algorithm, and intrinsic control algorithm. To demonstrate the function of this platform, in this study the NMI based on neuromuscular-mechanical fusion was hierarchically integrated with intrinsic control of a prototypical transfemoral prosthesis. One patient with a unilateral transfemoral amputation was recruited to evaluate our implemented neural controller when performing activities, such as standing, level-ground walking, ramp ascent, and ramp descent continuously in the laboratory. A novel experimental setup and protocol were developed in order to test the new prosthesis control safely and efficiently. The presented proof-of-concept platform and experimental setup and protocol could aid the future development and application of neurally-controlled powered artificial legs.

Neural-machine interfaces (NMI) have been developed to identify the user's locomotion mode. These NMIs are potentially useful for neural control of powered artificial legs, but have not been fully demonstrated. This paper presented (1) our designed engineering platform for easy implementation and development of neural control for powered lower limb prostheses and (2) an experimental setup and protocol in a laboratory environment to evaluate neurally-controlled artificial legs on patients with lower limb amputations safely and efficiently.

Technische Plattform und experimentelles Protokoll für Entwurf und Evaluation eines Neural-kontrollierten Powered Oberschenkelprothese

To enable intuitive operation of powered artificial legs, an interface between user and prosthesis that can recognize the user's movement intent is ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Verwendung Tomoauto: Ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Automated Kryo-Elektronentomographie

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

Synthese von Hydrogelen mit Antifouling-Eigenschaften als Membranen für die Wasserreinigung

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

Eingabe Leistungsmessungen in gerührten Bioreaktoren im Labormaßstab

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally delivering bioactive compounds to the salivary glands, greater tissue concentrations can be safely achieved versus systemic administration. Furthermore, off target tissue effects from extra-glandular accumulation of material can be dramatically reduced. In this regard, retroductal injection is a widely used method for investigating both salivary gland biology and pathophysiology. Retroductal administration of growth factors, primary cells, adenoviral vectors, and small molecule drugs has been shown to support gland function in the setting of injury. We have previously shown the efficacy of a retroductally injected nanoparticle-siRNA strategy to maintain gland function following irradiation. Here, a highly effective and reproducible method to administer nanomaterials to the murine submandibular gland through Wharton's duct is detailed (Figure 1). We describe accessing the oral cavity and outline the steps necessary to cannulate Wharton's duct, with further observations serving as quality checks throughout the procedure.

Local drug delivery to the submandibular glands is of interest in understanding salivary gland biology and for the development of novel therapeutics. We present an updated and detailed retroductal injection protocol, designed to improve delivery accuracy and experimental reproducibility. The application presented herein is the delivery of polymeric nanoparticles.

Retroductal Nanopartikel Injektion an der murinen mandibulären Drüse

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior of these materials. In the past, it has not been possible to satisfactorily measure the softening of thin films under conditions mimicking body environment without substantial effort. This publication presents a new and simple method that allows dynamic mechanical analysis (DMA) of polymers in solutions, such as phosphate buffered saline (PBS), at relevant temperatures. The use of environmental DMA allows measurement of the softening effects of polymers due to plasticization in various media and temperatures, which therefore allows a prediction of the materials behavior under in vivo conditions.

To allow reliable predictions of the softening of polymeric substrates for neural implants in an in vivo environment, it is important to have a reliable in vitro method. Here, the use of dynamic mechanical analysis in phosphate buffered saline at body temperature is presented.

Ökologische dynamische mechanische Analyse um die Erweichung Verhalten der neuronale Implantate

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Automated Counterflow Centrifugal System for Small-Scale Cell Processing

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and product concentration are essential components for most manufacturing processes. However, at the early stages of product development, these steps are often performed manually. Manual dead-end centrifugation for buffer exchange is labor-intensive, costly, and not scalable. A closed automated system can effectively eliminate this laborious step, but implementation can be challenging. Here, we describe a newly developed cell processing device that is suitable for small- to medium-scale cell processing and aims to bridge the gap between manual processing and large-scale automation. This protocol can be easily applied to various cell types and processes by modifying the flow rate and centrifugation speed. Our protocol demonstrated high cell recovery with shorter processing times in comparison to the manual process. Cells recovered from the automated process also maintained their proliferation rates. The device can be applied as a modular component in a closed manufacturing process to accommodate steps such as buffer exchange, cell formulation, and cryopreservation.

Automation is key to upscaling and cost management in cell manufacturing. This manuscript describes the use of a counterflow centrifugal cell processing device for automating the buffer exchange and cell concentration steps for small-scale bioprocessing.

Automatisiertes Gegenstromzentrifugalsystem für die Kleinzellverarbeitung

Successful commercialization of gene and cell-based therapies requires manufacturing processes that are cost-effective and scalable. Buffer exchange and ...