Das Hähnchen-Ziliarganglion ist eine Struktur, die im hinteren Teil des Auges lokalisiert ist und an den Sehnerv in der Aderhautspalte angrenzt. Und die Ziliar Ganglien Neuronen, gehören zum parasympathischen Nervensystem, und sind cholinerge Neuronen, und so können sie cholinerge Synapsen etablieren. Das Ziliarganglien besteht aus einer enormen Population von Ziliarneuronen und Aderhautneuronen, die strukturell und funktionell verschieden sind.
So die Ziliarneuronen innervates intraokularen Muskel, und Aderhautneuronen innervates Stimmungsmuskel im Auge. Und für die ersten Tage in der Kultur präsentieren die Ziliarganglien-Neuronen eine multipolare Morphologie, und danach beginnen sie, in einen unipolaren Zustand überzusteigen, in dem sich einer der Neuriten ausdehnt und das Axon bildet. Eine der häufigsten Studien mit ZiliarGanglien-Neuronen, ist eine Studie von neuromuskulären Synapsen, die cholinerge Synapsen sind, und die Verwendung von Ziliar Ganglien Neuronen hat sich zu einer guten Alternative, im Vergleich zu früheren Modellen, aufgrund der Tatsache, dass die neuronale Bevölkerung erhalten, ist homogen in dem Sinne, dass, alle Neuronen sind cholinergic, und so können sie funktionelle Synapes , was nicht geschieht, wenn wir mit einer neuronalen Population arbeiten, das ist nicht ganz cholinerg.
Die Identifizierung und Zerlegung des Ziliarganglials kann für jemanden, der es zum ersten Mal tut, eine ziemliche Herausforderung sein, daher bieten wir hier ein Schritt-für-Schritt-Protokoll, für die angemessene Identifizierung und Zerlegung des Ziliarganglien, sowie die Richtlinien für eine erfolgreiche Kultur dieser Neuronen. Für die Herstellung der Abdeckungen benötigen Sie 13 Millimeter Glasabdeckungen, einen säurebeständigen Behälter, 65% Salpetersäure, Pinzette, Milli-Q-Wasser, 75% Ethanol und einen Orbital-Shaker. Die Herstellung der Abdeckungen für Primärkulturen sollte zwei Tage vor dem Eingriff erfolgen.
Legen Sie die gewünschte Anzahl von Glasabdeckungen in einen säurebeständigen Behälter und fügen Sie 65% Salpetersäure hinzu, bis alle Abdeckungen abgedeckt sind. Legen Sie den Behälter in einen Orbital-Shaker und inkubieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur mit Rührung. Am nächsten Tag, entfernen Sie vorsichtig die Salpetersäure, und Stern für die Wiederverwendung.
Waschen Sie die Deckellipsen, fügen Sie Milli-Q-Wasser in den Behälter. Noch einmal, Rühren für 30 Minuten, entsorgen Sie die Waschlösung, und wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal. Spülen Sie die Deckellipsen zweimal mit 75% Ethanol.
Trennen sie sorgfältig und legen Sie einzelne Abdeckungen in ein Metallgestell, das mit Aluminiumfolie bedeckt ist, und brüten Sie bei 50 Grad, für 10 bis 15 Minuten oder bis sie vollständig trocken sind. Sterilisieren Sie die Abdeckungen im UV-Licht für 10 bis 15 Minuten. Für die Beschichtung der Abdeckungen benötigen Sie sterile Glasabdeckungen, eine 24-Well-Platte, eine sterile Pinzette, 0,1 Milligramm pro Milliliter PDL-Lösung, steriles Wasser, eine 10 Mikrogramm pro Milliliter-Lamininlösung, ein einfaches neurobasales Medium und Ziliarganglien-Gesamtmedium.
Die Beschichtung der Abdeckungen, sollte am Tag vor dem Eingriff durchgeführt werden. Mit einer sterilen Pinzette, legen Sie einen Deckelrutsch in jedem Brunnen einer 24-Well-Platte, fügen Sie 500 Mikroliter Poly-Dianalyse-Lösung, bei einer Konzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter, und inkubieren über Nacht bei 37 Grad. Am nächsten Tag die Deckeldreimal mit sterilem Wasser waschen, das Wasser entsorgen und 350 Mikroliter der Lamininlösung in einer Konzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter zu jedem Brunnen geben.
Platzieren Sie in einem Inkubator, bei 37 Grad für zwei Stunden. Nach dieser Zeit, und vor der Zellbeschichtung, entfernen Sie die Lamininlösung, und waschen Sie zweimal mit 300 Mikroliter des einfachen neurobasalen Mediums. Fügen Sie 300 Mikroliter des kompletten Mediums hinzu und legen Sie sie in einen Inkubator bei 37 Grad und 5% CO2, bis Sie bereit sind, Zellen zu verfestigen.
Für das Sezierverfahren benötigen Sie Hühnereier am 7. Tag, 75%Ethanol, Sezierzangen Nummer 545 und Nummer 55, Schere, einen Löffel, Sezierpetrischalen mit schwarzem Boden und eiskalte HBSS-Lösung. Achten Sie darauf, alle Sezierwerkzeuge in 75% Ethanol zu sterilisieren. Eier sollten bei 16 Grad gelagert werden, bevor sie in einem Eierbrutschrank, bei 37,7 Grad, für sieben Tage oder in einem anderen gewünschten embryonalen Stadium inkubiert werden.
Am Tag des Eingriffs die Eier aus dem Brutkasten entfernen, die Eier mit 75% Ethanol besprühen. Holen Sie sich die Oberseite des Eis mit einer Schere, und vorsichtig nehmen Sie die Stickerei mit einem Löffel. Legen Sie den Embryo in eine Petrischale mit eiskalter HBSS-Lösung und trennen Sie den Kopf sofort vom Körper, indem Sie sie im Nackenbereich schneiden.
Dann den Kopf auf eine neue Petrischale mit sauberer eiskalter HBSS-Lösung übertragen. Sobald der Embryo aus dem Ei entfernt wird, ist er in der Lage, Proteasen zu produzieren, die für den Zelltod verantwortlich sind. Daher ist es wichtig, den Kopf so schnell wie möglich vom Körper zu trennen, sobald sich der Embryo außerhalb des Eis befindet, um den Zelltod zu minimieren.
Es ist auch sehr wichtig, den Kopf des Embryos in eiskalte HBSS-Lösung zu halten. Halten Sie den Embryo kopf hoch, und fixieren Sie es im Schnabel des Kükens, und beginnen Sie dann, die dünne Schicht der Haut um das Auge zu entfernen. Entfernen Sie das Auge vorsichtig, indem Sie es vorsichtig vom Kopf wegdrehen.
Und während das Auge vom Kopf des Kükens getrennt wird, bemerken Sie, dass der Sehnerv geschnitten wird. Halten Sie das Auge mit der hinteren Seite nach oben, und bemerken Sie das Ziliarganglion, neben dem Sensor-Optiknerv und der Aderhautspalte. Der präganglionische Nerv könnte noch an dem Ziliarganglion befestigt werden, was seine Identifizierung erleichtert.
Sezieren Sie das Ziliarganglion von jedem Auge, und reinigen Sie es sehr gut, indem Sie das überschüssige Gewebe entfernen. Übertragen Sie die sezierten Ganglien auf eine Petrischale mit HBSS-Lösung auf Eis. Um eine Ausbeute von etwa 1 Million Zellen pro Milliliter zu haben, sollten Sie etwa 70 Ganglien sezieren, und auch daran denken, dass die erhaltene Zellpopulation auch nicht-neuronale Zellen hat, also um die Anzahl der nicht-neuronalen Zellen zu verringern und auch die Reinheit Ihrer neuranalen Population zu erhöhen, ist es wichtig, die Ziliarganglien sehr gut zu reinigen. , entfernen Sie das gesamte überschüssige Gewebe.
Für die Gewebedissoziation benötigen Sie eine 24-Well-Platte, 0,1%tripsin Lösung, unvollständige Ziliarganglienmedium, eine feuerpolierte Glaspasteurpipette und eine Kunststoffpasteurpipette. Pre-wet eine sterile Kunststoff Pasteur Pipette, und sammeln Sie alle Zilien Ganglien zu einem 15 ML Rohr, und Zentrifuge für zwei Minuten bei 200 Gs.Vorsichtig, entfernen Sie alle HBSS Medium, mit einer Pasteur Pipette, um ein größeres Volumen zu entfernen, und dann, wenn Sie näher an der Pellet sind, verwenden Sie eine Mikropipette. Fügen Sie einen Milliliter 0,1% tripsin Lösung, und inkubieren für 20 Minuten, bei 37 Grad in einem Wasserbad.
Zentrifuge für zwei Minuten, bei 200 Gs.Sofort entfernen Sie die Tripin-Lösung, und fügen Sie einen Milliliter unvollständiges Medium. Das Serum im unvollständigen Medium wird sofort die Aktivität von Trypsin stoppen. Zentrifugieren Sie für zwei Minuten bei 200 Gs, und entfernen Sie alle Medien.
Fügen Sie 500 Mikroliter des gesamten Mediums hinzu und starten Sie die Gewebedissoziation mit einer P1000-Mikropipette. Beginnen Sie mit dem Pipettieren nach oben und unten, 10 bis 15 Mal, und dann wechseln Sie zu einer feuerpolierten Glas Pasteur Pipette, und wieder, Pipette auf und ab 10 bis 15 Mal. Die Zellsuspension sollte als Zeichen einer erfolgreichen Gewebedissoziation verwischt werden.
Das notwendige Volumen, um Zellen zu dissoziieren, hängt von der Anzahl der darin erhaltenen Ziliarganglien und der Pelletgröße ab. Beim Pipetieren nach oben und unten, um ein Gewebe zu dissoziieren, ist es wichtig, die Bildung Luftblasen zu vermeiden, wird dies Zellverlust zu minimieren. Nach dem Wiederaufsetzen von Zellen können Sie die Zellsuspension bis zur Beschichtung auf Eis lassen.
Bestimmen Sie die Zelldichte mit einer Trypan-Blau-Lösung in der Neubauerkammer. Diese Bleizellsuspension in komplettem Medium, mit 5FTU, bei der gewünschten Dichte und Platte 500 Mikroliter Zellen pro Brunnen. Inkubieren Sie Zellen bei 37 Grad und 5%CO2.
Achten Sie darauf, unsere Kultur jeden Tag zu überprüfen und die Entwicklung von Zellen zu verfolgen. Ziliäre Ganglienzellen entwickeln sich ziemlich schnell in vitro, und nach einem Tag können wir bereits einige Neuriten sehen, die sich aus dem Zellkörper ausdehnen. Nach sieben bis acht Tagen in vitro ist das neuronale Netzwerk sehr gut etabliert, und die Zellen können für mindestens 15 Tage aufrechterhalten werden.
Nach einem Tag in vitro zeigen Ziliarganglien-Neuronen eine multipolare Mythologie. Jedoch, Neuriten-Erweiterung tritt schnell in den Neuronen sichtbar etabliert das neuronale Netzwerk, bereits nach 24 Stunden. In vitro sind Ziliarganglien-Neuronen für die Innervation des Muskels im Auge verantwortlich.
Und so, diese neuronalen Kulturen, sind sehr gut geeignet für die Untersuchung von neuromuskulären Synapsen. Dazu können Ziliarganglien-Neuronen auf Muskelzellen plattiert werden. Hier zeigen wir eine erfolgreiche Kultur, des Augenglaskörpers, CG-Neuronen, auf dem Auge V7 Küken pectral Muskelneuronen.
Synaptische Vesikelmarker, SV2, zeigen aktive Synapsen, die zwischen den CG Neuronen Axonen und den Muskelfasern etabliert sind, leicht durch die multiplen Kerne identifiziert. Ziliarganglion Neuronen mit diesem Protokoll erhalten sind für Immunzytochemie, Elektrophysiologie, und Überleben Essays unter anderem geeignet. Dieses Sezierprotokoll, ergibt eine sehr geringe Anzahl von Neuronen, aber wenn richtig gemacht, wird die reine Population von cholinergen Neuronen zur Verfügung stellen.
Es ist sehr wichtig, dass jede Ganglien sehr gut gereinigt ist und das überschüssige Gewebe entfernt wird. Dazu sollten hochwertige Instrumente eingesetzt werden, damit dieses Gewebe entfernt werden kann, um eine Kontamination durch nicht-neuronale Zellen zu verhindern. Das Alter des Embryos wird den Erfolg unseres Protokolls bestimmen.
Idealerweise sollte die Sezierung zwischen E7 und E8 durchgeführt werden. Dieser Zeitpunkt ist sehr wichtig, da in diesem Stadium der Entwicklungszelltod, der normalerweise in vitro auftritt, noch nicht eingetreten ist. Um die Kontamination dieser nicht-neuronalen Zellen zu minimieren, verwenden wir 5FTU in den Kulturmedien, um das Wachstum von Gliazellen und Fibroblasten zu minimieren. Dieses Zellmodell bietet eine ausgezeichnete Alternative für die Untersuchung Ihrer Nueromusclar-Krankheit.
Auf der Grundlage dieses Protokolls können zusätzliche wissenschaftliche Fragen behandelt werden, zum Beispiel, wie die Subzelllokalisierung bestimmter Karboate und spezifischer Proteine die Bildung und Funktion der Synapsen regulieren. Darüber hinaus ist es ziemlich einfach, Nervenmuskel-Kokulturen zu etablieren, um weitere Fragen wie die Untersuchung von neuromuskulären Erkrankungen anzugehen.
