Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von Kansas INBRE, P20GM103418 an Li und Zinovyeva und R35GM124828 an Zinovyeva. Wir danken Min Han für die großzügige gemeinsame Nutzung des Anti-AIN-1-Antikörpers. Einige der im Laufe dieser Arbeit verwendeten Stämme wurden vom Caenorhabditis Genetics Center (CGC) bereitgestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wurde.

1. Wurmprobensammlung
<ol><li>Samen gemischte Stufe oder synchronisiert13 Würmer auf NGM Feststoffplatten bei der erforderlichen Temperatur und lassen Sie die Würmer bis zum gewünschten Stadium wachsen. Grundlegende s. C. elegans Wachstum und Wartung finden Sie unter Stiernagle et al. und Porta-de-la-Riva et al.14,13.</li>
	<li>Sammeln Sie Würmer in einem 15 ml konischen Zentrifugenrohr, indem Sie die Schneckenplatten mit M9-Puffer waschen.</li>
	<li>Pellet die Würmer durch Zentrifugieren bei 400 x g bei Raumtemperatur (RT) für 2 min und entsorgen Sie den Überstand. HINWEIS: Die Schneckenpelletgröße für die Extraktzubereitung liegt zwischen 100 und 500 l. Für nachgelagerte Immunpräzipationsexperimente wird ein 300-L-Pellet verpackter Würmer empfohlen, der in der Regel 4,5 mg Gesamtprotein liefert, während ein 500-L-Pellet 7,5 mg Gesamtprotein ergibt.</li>
	<li>Führen Sie zusätzliche 3:5-Waschungen mit M9-Puffer (siehe Tabelle 1) oder bis der Überstand nicht mehr bewölkt ist.</li>
	<li>Führen Sie eine letzte Wäsche mit ddH2O durch.</li>
	<li>Das lose Schneckenpellet auf ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr verschieben und bei RT 2 min bei 400 x g drehen. Entsorgen Sie den verbleibenden Überstand, um ein gepacktes Wurmpellet zu erhalten, und fahren Sie mit der Extraktion der Zubereitung fort. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Wurmpellets können sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Bitte beachten Sie, dass Wurmpellets nur einmal aufgetaut werden können und nicht eingefroren werden können.</li>
</ol>2. Extraktvorbereitung des Schneckenpellets
HINWEIS: Die Extraktzubereitung sollte auf Eis oder bei 4 °C erfolgen.
<ol><li>Wenn gefroren, tauen Wurm Pellet auf Eis. HINWEIS: Wenn die gewünschte verpackte Schneckenpelletgröße von 300 l während der Probenentnahme nicht erreicht wurde, können mehrere kleinere Pellets kombiniert werden, bis genügend Material für die weitere Extraktion vorhanden ist.</li>
	<li>Fügen Sie ein gleiches Volumen eiskalter 2x Lysepuffer (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM Kaliumchlorid, 0,1% Triton X, 4 mM Magnesiumchlorid, 10% Glycerin, 2 mM DTT mit RNase-Hemmer, Protease-Inhibitor und Phosphatase-Inhibitoren hinzu; siehe Tabelle 1) und Wirbel oder Pipetten nach oben und unten, um sie zu mischen. Drehen Sie die Rohre nach unten, um das Gemisch an der Unterseite des Rohres zu sammeln.</li>
	<li>Die Mischung in ein 1,5 ml RNase-freies Rohr mit Metallperlen (siehe Materialtabelle)bewegen und die Probe in den Perlenmühlenhomogenisator (siehe Materialtabelle) bei 4 °C geben. Stellen Sie sicher, dass die Rohrkappen angezogen und die Proben innerhalb des Homogenisators ausbalanciert sind.</li>
	<li>Homogenisieren Sie die Probe mit der höchsten Geschwindigkeit (Einstellung 12) für 4 min.</li>
	<li>Entfernen Sie die Probe aus den Perlen und legen Sie sie in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Alternativ kann ein mit dem Homogenisator versehener Magnet verwendet werden, um die Perlen aus der Probe zu entfernen.</li>
	<li>Drehen Sie den Extrakt bei 19.000 x g für 20 min bei 4 °C, um den Proteinextrakt zu klären.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand in eine frische 1,5 ml Röhre auf Eis, während Sie die Übertragung des weißen, trüben Niederschlags vermeiden, der sich auf der Oberseite der Probe bildet. Der Überstand ist nun der geklärte Auszug. HINWEIS: Speichern Sie 10 l des geklärten Extraktes, um die Gesamtproteinkonzentration zu bestimmen.</li>
	<li>Verwenden Sie den Extrakt sofort für die folgenden Experimente oder blitzen Sie den Extrakt in flüssigem Stickstoff einfrieren und lagern Sie ihn bei -80 °C. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Extrakte können bei extrem niedriger Temperatur gelagert werden (-80 °C Gefrierschrank oder flüssiger Stickstoff für 6 Monate). Gefrorene Extrakte können einmal aufgetaut und nicht eingefroren werden.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration des Extrakts anhand eines mit Reinigungsmitteln kompatiblen Proteinkonzentrations-Assay-Kits (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
</ol>3. Immunitizipation
HINWEIS: Alle Immunpräzipitungsschritte zur Extraktpräparation sollten auf Eis oder bei 4 °C durchgeführt werden. Es wird empfohlen, 2 mg Gesamtprotein für jede Immunpräzipitation zu verwenden. Es wurden jedoch erfolgreiche Immunpräzipitationen mit 0,8–1 mg Gesamtprotein durchgeführt. Verwenden Sie immer frische oder frisch aufgetaute Proteinextrakte. Das folgende Protokoll wird beschrieben, um Immunpräzipitation von 2 mg Gesamtprotein oder ein einzelnes Immunpräzipitationsexperiment durchzuführen. Die Menge an Perlen und Antikörpern kann bei mehreren Proben oder bei Verwendung einer anderen Menge an Proteinextrakt entsprechend erhöht oder verringert werden.
<ol><li>Den Proteinextrakt auf Eis legen oder auftauen. Die Probe kann auf 10 mg/ml oder 5 mg/ml mit eiskaltem 1x Lysepuffer verdünnt werden (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Setzen Sie die magnetischen Perlen durch Inversion wieder auf und übertragen Sie 150 l der 50%igen Perlensuspension in ein 1,5 ml Rohr. Magnetisieren Sie die Perlen auf Eis gegen einen magnetischen Ständer für 1 min oder bis die Lösung klar ist. Entsorgen Sie den Überstand.</li>
	<li>Entfernen Sie das Rohr aus dem magnetischen Ständer und waschen Sie die Perlen in 1x Lysepuffer mit 2 Bänden (d. h. 300 l) Perlenschlämme. Wiederholen Sie die Wäsche 2x für insgesamt drei Wäschen.</li>
	<li>Setzen Sie die Perlen in 150 l eiskalten Lysepuffer aus.</li>
	<li>75 l der Perlenschlämme auf 2 mg Proteinextrakt übertragen und bei 4 °C für 1 h mit sanfter Rührung inkubieren. Speichern Sie die verbleibende Perlensuspension auf Eis für die spätere Verwendung. HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt, um die unspezifische Proteinbindung an Perlen während des Immunpräzipitationsschritts zu reduzieren.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr mit Probe auf den magnetischen Ständer auf Eis für 1 min oder bis die Perlen vollständig magnetisiert sind und die Probe klar ist. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr; die Perlen nicht stören. Dies ist das vorgereinigte Proteinlysat. Sparen Sie 10 % der Stichprobe für die Western Blot-Analyse.</li>
	<li>Fügen Sie dem vorgereinigten Lysat 20 g affinitätsgereinigten Antikörper hinzu und inkubieren Sie bei 4 °C für 1 h mit sanfter Rührung. HINWEIS: Die Menge an Antikörpern, die für Die Immunpräzipitation verwendet werden, ist spezifisch für Antikörper und Protein eisern und sollte empirisch bestimmt werden, um eine wirksame Immunpräzipation des Zielproteins zu gewährleisten.</li>
	<li>Die restlichen 75 l der vorgewaschenen Perlensuspension (Schritt 3.5) in das Antikörper-Lysat-Gemisch geben und bei 4 °C mit sanfter Rührung 1 h bebrüten.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr in den magnetischen Ständer auf Eis für 1 min oder bis die Perlen vollständig magnetisiert sind und die Probe klar ist. Speichern Sie den Überstand für die Western Blot-Analyse (optional).</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen, die das Immunprecipitat 3x in 450 l Waschpuffer (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM Kaliumchlorid, 0,1% Triton X, 2 mM Magnesiumchlorid, 10% Glycerin, 1 mM DTT; siehe Tabelle 1) auf Eis enthalten. HINWEIS: Zusätzliche Waschungen können durchgeführt werden, wenn strengere Waschbedingungen bevorzugt werden.</li>
	<li>Setzen Sie das Perlenpellet in 20 l 2x SDS/BME-Proteingel-Ladepuffer (siehe Materialtabelle)wieder auf und denaturieren Sie das Perlenpellet 5 min vor dem Laden auf ein SDS-PAGE-Gel. Alternativ können denaturierte Proben mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden. HINWEIS: Ein Teil des Perlenimmunprecipitats kann auf Wunsch für die nachgeschaltete RNA-Isolierung gespeichert werden.</li>
</ol>4. Western Blot-Erkennung von IP-Proben
<ol><li>Laden Sie die IP-Proben auf das SDS-PAGE-Gel (siehe Materialtabelle). Vermeiden Sie die Übertragung der Perlen, indem Sie die IP-Röhren für 1 min vor der Aspiration der Probe auf den magnetischen Ständer legen.</li>
	<li>Führen Sie die Western Blotting15,16 und Antikörper Färbung16 mit den folgenden Modifikationen: verdünnen Sie den ALG-1 Antikörper17 1:500 in 5% fettfreie Trockenmilch (NFDM); den HRPK-1-Antikörper2 1:1.000 in 5% NFDM verdünnen; und verdünnen Sie den AIN-1-Antikörper18 1:10.000 in 5% NFDM. Sekundäre Antikörper (siehe Materialtabelle) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.</li>
	<li>Erkennen Sie die Bänder mit HRP-basierter Chemilumineszenz (siehe Materialtabelle).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 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K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

C. elegans ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung grundlegender Fragen in der Zell-, Molekular- und Entwicklungsbiologie19. Zusätzlich zu seiner Macht als genetisches Modellsystem ist C. elegans für biochemische Ansätze geeignet, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Protein-Immunpräzipitation und Co-Immunpräzipation. Eine mögliche Hürde bei der Durchführung von Immunpräzipitationsexperimenten ist der Mangel an Antikörpern, die für die Proteine von Interesse spezifisch sind. Wenn kein Antikörper verfügbar ist, können benutzerdefinierte polyklonale oder monoklonale Antikörper erzeugt werden. Jüngste Innovationen in der Genom-Editing-Technologie haben es Forschern jedoch ermöglicht, schnell Mutationen einzuführen oder endogene C. elegans Gene20,21zu markieren, was Studien erleichtert, die die genetischen, funktionellen und physikalischen Wechselwirkungen zwischen den Genen und den kodierten Proteinen entwirren. Insbesondere die CRISPR/Cas9-vermittelte Kennzeichnung von C. elegans-Genen an den endogenen Loci hat die Abhängigkeit von Immunpräzipitationsexperimenten von der Verfügbarkeit von Antikörpern reduziert und Co-Immunpräzipitationsexperimente viel realisierbarer gemacht. C. elegans Gene können mit einer Vielzahl von Tags getaggt werden, die von fluoreszierenden Tags wie GFP oder mCherry bis hin zu kleinen Tags wie FLAG und HA reichen. Antikörper, die diese Tags erkennen, sind leicht kommerziell verfügbar, was die Studien von Protein-Protein-Wechselwirkungen über Immunpräzipationsansätze erleichtert.
Das vorgelegte Protokoll, das in Abbildung 1beschrieben ist, kann für eine kleine Anzahl von Proben durchgeführt oder skaliert werden, so dass bis zu 24 Probenpräparate gleichzeitig möglich sind. Während die anfänglichen Charakterisierungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen über Immunpräzipitation enthoben in der Regel in wilden Hintergründen unter normalen Wachstumsbedingungen erfolgen, erfordern Folgestudien häufig Tests der Protein-Protein-Wechselwirkungen in einer Vielzahl von genetischen Hintergründen oder unter verschiedenen Wachstumsbedingungen. Die Möglichkeit, mehrere Extrakte gleichzeitig vorzubereiten, spart Zeit und sorgt vor allem für die Konsistenz der Extraktvorbereitung zwischen den verschiedenen Proben. Eine negative Kontrolle ist immer erforderlich, wobei die ideale Kontrolle eine Nullmutation in der Genkodierung für das immunvorzeichnetse Protein ist (Beispiele siehe Abbildung 3 und Abbildung 4).
Dieses Extraktprotokoll ermöglicht eine schnelle Proteinextrakt-Präparation aus C. elegans Proben und ist vergleichbar mit der zirkoniumperlenbasierten Homogenisierung8. Die Perlenhomogenisierung kann im Allgemeinen mit einer Vielzahl von Perlenmühlenhomogenisatoren oder ähnlichen Geräten auf mehrere gleichzeitige Probenpräparate skaliert werden. Einige wirtschaftlichere Perlenmühlenhomogenisatoren können jedoch die Anzahl der Proben reduzieren, die gleichzeitig verarbeitet werden können. Alternativ ist das vorgestellte Extraktprotokoll mit der dounce-basierten Extraktzubereitung kompatibel, was eine wirtschaftliche Alternative darstellt. Während verschiedene Perlenmühlenhomogenisatoren nicht getestet wurden, sind die meisten wahrscheinlich mit diesem Proteinextrakt-Protokoll kompatibel, solange eine vollständige Störung der C. elegans Proben erreicht wird.
Wie dargestellt, ist dieses Extraktvorbereitungsprotokoll mit mehreren nachgeschalteten Experimenten kompatibel, einschließlich Proteinimmunpräzipitation2 und microRNA Pull-down12 und ermöglicht die nachgelagerte Sammlung von Protein- und RNA-Komponenten. Es extrahiert auch effizient sowohl kerntechnische als auch zytoplasmatische Proteine (Abbildung 2, Abbildung 3und Abbildung 4). In ähnlicher Weise ermöglicht das vorgestellte Immunpräzipitationsprotokoll die RNA-Isolierung von proteinassoziierten Immunpräcipitaten. Während das Immunpräzipitationsprotokoll ursprünglich entwickelt wurde, um ALG-1-Proteininterakisatoren zu identifizieren, kann die Methode angepasst werden, um Wechselwirkungen zwischen beliebigen Proteinen zu testen. Tatsächlich funktionierten die verwendeten Immunpräzipitationsbedingungen bei der Immunpräzipierung von ALG-1 (Abbildung 3) und HRPK-1 (Abbildung 4) gleichermaßen gut. Dieses Protokoll ist ein ausgezeichneter Ausgangspunkt für die Immunreinigung von RNA-bindenden Proteinen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass einige Änderungen in der Pufferzusammensetzung für andere Proteine von Interesse erforderlich sein können. Die Veränderungen können von den physikalischen und biochemischen Eigenschaften des von Interesse sindden Proteins abhängen und müssen von Fall zu Fall umgesetzt werden.
Sobald das Zielprotein (hier ALG-1 oder HRPK-1) immunprezipiert ist, kann Western Blotting verwendet werden, um das Co-Immunoprecipitat auf bestimmte Proteininteraktoren zu testen.
Alternativ kann das korifizierte Immunprecipitat einer Massenspektrometrieanalyse unterzogen werden, um alle vermeintlich interagierenden Proteine zu identifizieren. Bestätigte Co-Immunpräzipitations-Wechselwirkungen können dann in einer Vielzahl von genetischen Hintergründen oder Bedingungen untersucht werden, um eine mögliche Regulierung der spezifischen Wechselwirkung zu identifizieren. Um beispielsweise festzustellen, ob hrpk-1 eine Rolle in der ALG-1/AIN-1 miRISC-Assembly spielt, wurde die ALG-1-AIN-1-Kopräzipation sowohl in einem wilden Typ-Hintergrund als auch in Abwesenheit von HRPK-1 (Abbildung 3) bewertet. hrpk-1 erwies sich als entbehrlich für DIE ALG-1/AIN-1-Wechselwirkung2 (Abbildung 3). Darüber hinaus kann die CRISPR/Cas9 Genom-Editing-Technologie eingesetzt werden, um Single-Point- oder Domain-Löschmutationen in den proteinen von Interesse zu erzeugen. Das erneute Testen der Fähigkeit der erzeugten Mutanten, mit ihren Proteininteraktoren zu koprezipieren, kann zeigen, welche Domänen oder Rückstände die physikalische Interaktion vermitteln. Solche zukünftigen Studien können unschätzbare Informationen über den Mechanismus der Proteinfunktion und -regulierung liefern. Diese Ansätze, kombiniert mit der Kraft der C. elegans Genetik, können wichtige Einblicke in die grundlegenden molekularen Prozesse liefern, die die Entwicklung und Zellfunktion von Tieren steuern.

Die Identifizierung der makromolekularen Wechselwirkungen eines Proteins von Interesse kann der Schlüssel sein, um mehr über seine Funktion zu lernen. Immunpräzipitations- und Co-Immunpräzipitationsexperimente können verwendet werden, um das gesamte Interom eines Proteins durch groß angelegte proteomische Ansätze1 zu identifizieren oder speziell die Fähigkeit eines Proteins zu testen, mit einem hypothetischen Interaktor zu koprezipieren. In C. eleganswurden beide Methoden erfolgreich eingesetzt, um mehr über die Aktivität einer Vielzahl von Proteinen zu erfahren, einschließlich derjenigen, die eng mit microRNAs zusammenarbeiten, um die Genexpression2,3,4zu regulieren. Co-Immunpräzipitationsexperimente haben den Vorteil, die Protein-Protein-Wechselwirkungen in ihrer nativen zellulären Umgebung zu testen, aber die Extraktpräparation kann herausfordernd und zeitaufwändig sein. Eine effiziente Lyse der Probe ist notwendig, aber es muss darauf geachtet werden, die Störung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zu minimieren. Methoden wie Douncing5, Beschallung6, Balch Homogenisierung7und Zirkonia Perlen-Homogenisierung8,9 wurden verwendet, um C. elegans Gesamtproteinextrakte erfolgreich vorzubereiten. Diese Methoden, mit Ausnahme der Zirkonia-Perlenhomogenisierung, haben Einschränkungen in Bezug auf die Anzahl der Proben, die gleichzeitig verarbeitet werden können. Präsentiert ist eine alternative Methode, die leicht skaliert werden kann, um eine schnelle Proteinextrakt-Präparation mit hohem Durchsatz aus C. elegans-Proben mit anschließender Co-Immunpräzipation zuermöglichen. Insbesondere kann die Methode bis zu 24 Proben gleichzeitig vorbereiten, wodurch die Zeit für die Extraktvorbereitung erheblich reduziert wird. Im Gegensatz dazu erlaubt z. B. das Douncing in der Regel nur eine Probenvorbereitung nach der anderen. Diese Extraktmethode kann verwendet werden, um Extrakte aus jeder Entwicklungsphase von C. elegansvorzubereiten.
Beschrieben wird ein schrittweises Verfahren zur Entnahme von Tierproben, zur Extraktpräparation, Immunpräzipitation und zur Darstellung von Western Blotting-Daten, um einen erfolgreichen Proteinabzug und den Nachweis des mitimmunisierenden Proteins zu bestätigen. Um die Wirksamkeit des Protokolls zu demonstrieren, wurden zwei Co-Immunpräzipationsexperimente zwischen 1) microRNA Argonaute ALG-1 und AIN-1, einem GW182-Homolog, durchgeführt; und 2) ALG-1 und HRPK-1, ein neu identifizierter ALG-1-Interaktor2. ALG-1 und AIN-1 sind Kernproteine, die den microRNA-induzierten Silencing-Komplex (miRISC) bilden und die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Proteinen ist gut etabliert10,11. Das Extraktpräparationsprotokoll war im ALG-1-AIN-1-Koimmunpräzipitationsexperiment wirksam. Dieses Protokoll bestätigte auch erfolgreich die Interaktion zwischen ALG-1 und seinem neu identifizierten Interaktor HRPK-12.
Zusammenfassend beschreibt das Manuskript ein C. elegans Extrakt-Vorbereitungsprotokoll, das bis zur gleichzeitigen Verarbeitung von 24 Proben skaliert werden kann, zusammen mit einem Co-Immuno-Blutungsprotokoll, das verwendet werden kann, um neue oder hypothetische Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu identifizieren oder zu bestätigen. Das Extraktvorbereitungsprotokoll ist mit einer Reihe von nachgeschalteten Experimenten kompatibel, einschließlich Proteinimmunpräzipitation2 und microRNA Pulldowns12. Darüber hinaus kann das Immunpräzipitationsprotokoll angepasst werden, um Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehr endogenen, endogen markierten oder überexprimierten C. elegans-Proteinen in einer Vielzahl genetischer Hintergründe zu testen.

<table><tbody><tr><td>15 mL tube</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>STEP 1.2</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>STEP 3.11</td></tr><tr><td>4&amp;ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>anti-AIN-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td></tr><tr><td>anti-ALG-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>EDTA-free protease inhibitors</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>GFP antibody (FL)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8334</td><td>Figure 2</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>STEP 4.3</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>M65-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>STEP 1.6</td></tr><tr><td>N2 wild type</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td><td>MidSci</td><td>NAVYR1-RNA</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>P217-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Thermo Fisher</td><td>P285-3</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>RC DC Protein Assay Kit I</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>STEP 2.9</td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>S374-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT3841 alg-1(tm492)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

Co-Immunpräzipitationsmethoden werden häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Die Bestätigung von hypothetischen Protein-Protein-Wechselwirkungen oder die Identifizierung neuer Protein-Wechselwirkungen können unschätzbare Informationen über die Funktion eines von Interesse sindden Proteins liefern. Einige der traditionellen Methoden zur Extraktzubereitung erfordern häufig arbeitsintensive und zeitaufwändige Techniken. Hier wird ein modifiziertes Extraktvorbereitungsprotokoll mit einem Perlenmühlenhomogenisator und Metallperlen als schnelle Alternative zu herkömmlichen Proteinaufbereitungsmethoden beschrieben. Diese Extraktpräparationsmethode ist mit nachgeschalteten Co-Immunpräzipitationsstudien kompatibel. Als Beispiel wurde die Methode verwendet, um C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 und zwei bekannte ALG-1 Interaktoren erfolgreich zu koimmunisieren: AIN-1 und HRPK-1. Dieses Protokoll enthält Beschreibungen der Probenentnahme, der Extraktzubereitung, der Extraktklärung und der Proteinimmunpräzipitation. Das beschriebene Protokoll kann angepasst werden, um Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehr endogenen, endogen markierten oder überexprimierten C. elegans Proteinen in einer Vielzahl genetischer Hintergründe zu testen.

Dieses Protokoll (schematisiert in Abbildung 1) wurde erfolgreich verwendet, um C. elegans Gesamtproteinextrakte zu erhalten (Abbildung 2) für die nachgeschaltete Immunitizipation mehrerer Proteine2 (Abbildung 3 und Abbildung 4). Das vorgestellte K.o.-Protokoll zur Homogenisatoren-Gesamtmenge war mit douncebasierten Methoden (Abbildung 2) und effizient extrahierten Kernkernen (COL-19::GFP(NLS) (Abbildung 2) und zytoplasmatischen Proteinen ( Abbildung3 und Abbildung 4) vergleichbar. Mehrere Proben unterschiedlicher Größe wurden gleichzeitig extrahiert (Abbildung 2). Argonaute-Proteine interagieren mit Mitgliedern der GW182-Proteinfamilie und bilden die miRISCs, die an den Zielboten RNAs binden und ihre Expression unterdrücken10. Abbildung 3 zeigt die erfolgreiche Koimmunpräzipation der kernigen miRISC-Komponenten ALG-1 und AIN-1, im Einklang mit früheren Berichten11,17. In jüngerer Zeit wurden Anstrengungen unternommen, um zusätzliche Proteininteraktoren von Argonaute ALG-13 zu identifizieren, um mehr darüber zu erfahren, wie die MikroRNA-Biogenese und -aktivität durch Hilfsfaktoren reguliert werden könnte. Das RNA-bindende Protein HRPK-1 wurde in ALG-1-Immunpräcipitaten3identifiziert. Diese Wechselwirkung wurde kürzlich in einem reziprokierten HRPK-1-Immunpräzipitationsexperimentbestätigt 2. Die vorgestellten Extrakt- und Immunpräzipitationsprotokolle haben ALG-1 erfolgreich in HRPK-1-spezifischen Co-Immunpräcipitaten wiederhergestellt (Abbildung 4). Darüber hinaus wurde die ALG-1-AIN-1-Wechselwirkung in einer Vielzahl von genetischen Hintergründen getestet und HRPK-1 erwies sich für die ALG-1/AIN-1 miRISC-Baugruppe2 (Abbildung 3) als unnötig. Zusätzliche Zahlen werden zur Verfügung gestellt, um die vollständige Membransonde zu zeigen (Ergänzende Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Abbildung 1: Workflow-Schema für C. elegans Extrakt-Präparation und Immunpräzipitation. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Abbildung 2: Western Blot Vergleich eines nuklear lokalisierten GFP, COL-19::GFP(NLS), Gehalte in dounce-prepared und homogenisierten Proben aus 250 l und 100 l Wurmpellets. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Abbildung 3: GW182 Homolog AIN-1 co-immunoprecipitates mit ALG-1. Western Blotting für ALG-1- und AIN-1-Proteine in ALG-1-Immunpräcipitaten. Die ALG-1/AIN-1 Co-Immunpräzipitation wurde durch das Fehlen von hrpk-1 nicht beeinflusst. Eingang = 10% der IP. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Abbildung 4: ALG-1-Co-Immunpräcipitate mit HRPK-1. Western Blotting für HRPK-1 und ALG-1 in HRPK-1-Immunpräcipitaten wird gezeigt. Eingang = 10% der IP. * zeigt eine schwere Antikörperkette an. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">M9-Puffer (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>bis 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Lysispuffer (5 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% Glycerin</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>bis zu 5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Frisch hinzufügen:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA-freier Protease-Inhibitor</td>
			<td>1 Tablette</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2</td>
			<td>100 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 3</td>
			<td>100 l</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Lysis-Puffer</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Lysispuffer mit gleichem Volumen von ddH20 verdünnen.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Waschpuffer 10 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 l</td>
		</tr>
<tr>
<td>100% Glycerin</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>bis 10 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 l (frisch hinzufügen)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Rezepte
Ergänzende Abbildung 1. Es werden vollständig sonsonierte westliche Blotmembranen gezeigt, die zur Erzeugung von Figuren 2-4 verwendet werden. (A) Sondenmembran für Abbildung 2. Beachten Sie, dass die Membran geschnitten wurde, um gleichzeitige Sondierungen für GFP und Tubulin zu ermöglichen, wodurch die Gesamtfleckgröße reduziert wurde. (B) Sondenmembran für Abbildung 3. (C) Sondenmembran für Abbildung 3. *bezeichnet die schwere Kette des Antikörpers. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Diese Methode beschreibt ein Protokoll zur Herstellung von Proteinextrakten mit hohem Durchsatz aus Caenorhabditis elegans Proben und anschließender Co-Immunpräzipation.

Proteinextrakt-Präparation und Co-Immunpräzipitation von Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.7K Aufrufe.  Kansas State University. Diese Methode beschreibt ein Protokoll zur Herstellung von Proteinextrakten mit hohem Durchsatz aus Caenorhabditis elegans Proben und anschließender Co-Immunpräzipation.

Serie: Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

Identifizierung von EGFR- und RAS-Inhibitoren mittels Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Forschung

Krebsforschung

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen bei Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Biochemie

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Biologie

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Kombinierte Nukleotid- und Protein Extraktionen in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble proteins over 40% of the time results in an extension of the lifespan in C. elegans, suggesting that many of these proteins are key determinants of the aging process. Isolation and quantitative identification of these insoluble proteins are crucial to understand key biological processes that occur during aging. Here, we present a modified and improved protocol that details how to extract and isolate the SDS-insoluble proteins (insolublome) from C. elegans more efficiently to streamline mass spectrometric workflows via a novel label-free quantitative proteomics analysis. This improved protocol utilizes a highly efficient sonicator for worm lysis that greatly increases efficiency for protein extraction and allows us to use significantly less starting material (approximately 3,000 worms) than in previous protocols (typically using at least 40,000 worms). Subsequent quantitative proteomic analysis of the insolublome was performed using data-dependent acquisition (DDA) for protein discovery and identification and data-independent acquisition (DIA) for comprehensive and more accurate protein quantification. Bioinformatic analysis of quantified proteins provides potential candidates that can be easily followed up with other molecular methods in C. elegans. With this workflow, we routinely identify more than 1000 proteins and quantify more than 500 proteins. This new protocol enables efficient compound screening with C. elegans. Here, we validated and applied this improved protocol to wild-type C. elegans N2-Bristol strain and confirmed that aged day-10 N2 worms showed greater accumulation of the insolublome than day-2 young worms.

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

This novel workflow efficiently extracts and isolates SDS-insoluble proteins (insolublome) from Caenorhabditis elegans with minimal starting material for quantitative differential proteomic analysis. The protocol uses a comprehensive data-independent acquisition mass spectrometry analysis to quantify the insolublome and bioinformatic analysis to gain biological insights into aging mechanisms and pathologies.

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Single Cell Dissociation of Caenorhabditis elegans: A Method to Isolate Live Cells

Source: Germany, E. M., et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/60145/isolation-specific-neuron-populations-from-roundworm-caenorhabditis">Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a method to dissociate whole worms into a single-cell suspension suitable for FACS or immunoprecipitation of intact cells.

Einzelzelldissoziation von Caenorhabditis elegans: Eine Methode zur Isolierung lebender Zellen

Source: Germany, E. M., et al. Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes a ...

Proteinextrakt-Präparation und Co-Immunpräzipitation von Caenorhabditis elegans

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Identifizierung von EGFR- und RAS-Inhibitoren mittels Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting zur Untersuchung von Protein-Wechselwirkungen bei Caenorhabditis elegans

Isolierung von aktivem Caenorhabditis elegans Kernextrakt und Rekonstitution für in vitro Transkription

Prostaglandin Extraktion und Analyse in

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

Kombinierte Nukleotid- und Protein Extraktionen in Caenorhabditis elegans

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

Kleine Extraktion von Caenorhabditis elegans Genomischer DNA

Einzelzelldissoziation von Caenorhabditis elegans: Eine Methode zur Isolierung lebender Zellen