Diese Arbeit wurde vom Lawrence Livermore National Lab LDRD 18-ERD-062 (an C.R.) finanziert. Vielen Dank an John Muschler für seine freundliche Spende der DgKO- und DgKI-Zellen. Vielen Dank an die Mitarbeiter des Berkeley Electron Microscope Laboratory der University of California für ihre Beratung und Unterstützung bei der Vorbereitung und Datenerfassung von Elektronenmikroskopie-Proben.

1. Auftauen und aliquotes Laminin-111
HINWEIS: Aufgereinigtes Laminin-111 ist im Handel erhältlich (typischerweise gereinigt aus EHS-Matrix, die als Matrigel verkauft wird), aber nicht alle Quellen liefern intaktes, nicht abgebautes Protein.
<ol><li>Bestätigen Sie, dass Ln1 nicht durch Beschaffung von Ln1 und Laufgrößenausschlusschromatographie26 oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese26 abgebaut wird. Denaturiertes Ln1 sollte Banden bei 337 kDa, 197 kDa und 177 kDa haben, und natives Ln1 sollte ein einzelnes Band bei 711 kDa haben.</li>
	<li>Ln1 über Nacht auf Eis im Kühlschrank auftauen und in Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Proteinbindung aliquotieren (typischerweise aliquotiert bei 100 μg/Röhrchen für Kulturüberlagerungen oder 10 μg für Beschichtungen) unter Verwendung proteinarmer Bindungsspitzen und steriler Technik27. Aliquote einfrieren und bei -80 °C lagern.</li>
</ol>2. Lamininpolymerisation mit Puffern mit niedrigem pH-Wert

<ol><li>PolyLM-Polymerisationspuffer herstellen: 1 mM CaCl2 und 20 mM Natriumacetat in Reinstwasser abwiegen und mischen. Stellen Sie dann den pH-Wert mit HCl oder Essigsäure auf 4,0 ein. Sterilfiltrieren Sie durch einen 0,2-μm-Filter und lagern Sie ihn bei 4 °C.</li>
	<li>Stellen Sie einen Kontrollpolymerisationspuffer her: Mischen Sie 1 mM CalCl2 und 20 mM Tris und stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein, wobei Sie je nach Bedarf 10 N HCl oder 12 N NaOH verwenden. Sterilfiltrieren Sie durch einen 0,2-μm-Filter und lagern Sie ihn bei 4 °C. HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	<li>Tauen Sie die benötigte Anzahl von Ln-1-Aliquoten über Nacht im Kühlschrank auf.</li>
	<li>Unter Verwendung der sterilen Zellkulturtechnik den entsprechenden Puffer (entweder PolyLM-Polymerisationspuffer aus Schritt 2.1 oder Kontrollpolymerisationspuffer aus Schritt 2.2) zu Laminin-Aliquoten in einer Endkonzentration von 100 μg/ml geben (d. h. 0,5 ml bis 50 μg Aliquote hinzufügen) und vorsichtig durch Pipettieren mischen.</li>
	<li>Wenn Sie fluoreszenzmarkiertes Laminin zur Visualisierung verwenden, rekonstituieren und im Verhältnis 1:50 Gew./Gew. (z. B. 2 μg/100 μg) hinzufügen und vorsichtig durch Pipettieren mischen. HINWEIS: Wenn Sie Laminine als Substrat für die Zellanhaftung verwenden, befolgen Sie die Schritte 2.6-2.8:</li>
	<li>Unmittelbar nach der Verdünnung in geeignetem Puffer werden Laminine auf Kulturkunststoff oder Glaswaren übertragen und über Nacht in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C inkubiert. Beachten Sie, dass beim Beschichten von Deckgläsern ein ausreichend großes Volumen hinzugefügt wird, um einen ausgeglichenen Tropfen zu erzeugen (in der Regel 50 μl für ein rundes 13-mm-Deckglas verwenden), und über Nacht bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer aufbewahren.</li>
	<li>Mit steriler Technik27 mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Flüssigkeit vorsichtig. Lassen Sie die Oberfläche nicht vollständig trocken sein. Anmerkungen: Wenn Sie Laminine verwenden, um Zellen für die Milchproteininduktion abzudecken, befolgen Sie die Schritte 2.9-2.12:</li>
	<li>Kultivieren Sie Brustepithelzellen. Kultivieren Sie MepG-Dystroglykan-Knock-in- (DgKI) oder MepG-Dystroglykan-Knockout-Zellen (DgKO) in DMEM-F12, ergänzt mit 2 % FBS, 0,01 mg/ml Insulin, 0,005 μg/ml EGF, 0,05 mg/ml Gentamycin und 0,05 g/ml Normocin.</li>
	<li>Seed-DgKO- und DgKI-Zellen für die Lamininstimulation bei 10.500 Zellen/cm2 in Well-Platten oder Deckglasböden</li>
	<li>Verdünnte Laminine in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie polyLM 20 Minuten lang bei 2.000 x g , aber zentrifugieren Sie LM bei neutralem pH-Wert bei 20.000 x g für 20 Minuten, da die Proteineinheiten kleiner sind und höhere Geschwindigkeiten erforderlich sind, um effektiv zu sammeln.</li>
	<li>Unter Verwendung der sterilen Technik27 wird der Überstand vorsichtig entfernt und in einem geeigneten Volumen des Induktionsmediums DMEM-F12, ergänzt mit 3 μg/ml Prolaktin, 2,8 μM Hydrocortison und 5 μg/ml Insulin, resuspendiert</li>
	<li>Laminin sofort in Zellkulturmedium übertragen, um die Zellen zu stimulieren. Wir haben erfolgreich Zellen mit 50-800 μg/ml Ln1 stimuliert</li>
</ol>3. Lamininpolymerisation mit isolierten Glykoproteinen
<ol><li>Rekombinantes Nidogen-1 und Ln1 über Nacht sanft auf Eis im Kühlschrank auftauen.</li>
	<li>Mischen Sie Ln1 mit Nidogen-1 in einem Verhältnis von 1:1 Gew./Gew. in Zellkulturmedium mit proteinarmen Bindungsspitzen und -röhrchen und mit steriler Technik. Verwenden Sie reines Ln1 in Zellkulturmedium als Kontrolle.</li>
	<li>Wenn Sie fluoreszenzmarkiertes Laminin zur Visualisierung verwenden, rekonstituieren Sie es und fügen Sie es im Verhältnis 1:50 Gew./Gew. hinzu (z. B. 2 μg/100 μg). Vorsichtig durch Pipettieren mischen.</li>
	<li>Inkubieren Sie Ln1-Nidogen oder kontrollieren Sie Ln1 in einem Zellkulturinkubator bei 37 °C für 30 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Ln1-Nidogen-Copolymere bei 2.000 x g für 30 min und die Steuerung Ln1 bei 20.000 x g für 30 min.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie ihn im Zellkulturmedium auf eine Endkonzentration von 100-800 μg Gesamtprotein/ml.</li>
	<li>Zur Stimulierung der Zellen sofort anwenden oder auf Deckgläser übertragen und über Nacht bei 37 °C in befeuchteten Zellkultur-Inkubatoren einwirken lassen.</li>
	<li>Kulturmedium von Deckgläsern entfernen, Deckgläser mit 1x PBS waschen und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 10% Formalin (d.h. 4% Formaldehyd in PBS) fixieren.</li>
</ol>4. Lamininpolymerisation mit Dystroglykan-exprimierenden Zellen
<ol><li>Kultivieren Sie Brustepithelzellen. Kultivieren Sie MepG-Dystroglykan-Knock-in- (DgKI) oder MepG-Dystroglykan-Knockout-Zellen (DgKO) in DMEM-F12, ergänzt mit 2 % FBS, 0,01 mg/ml Insulin, 0,005 μg/ml EGF, 0,05 mg/ml Gentamycin und 0,05 g/ml Normocin.</li>
	<li>Seed-DgKI-Zellen bei 5.000 Zellen/cm2 und Seed-DgKO-Zellen bei 8.000 Zellen/cm2 aufgrund unterschiedlicher Wachstumsraten. Kultur bei 37 °C in befeuchteten Inkubatoren mit Medienwechsel alle 2-3 Tage und Durchgängen alle 4-5 Tage in einer strengen sterilen Technik. Zählen Sie die Zellen sorgfältig mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler27 , um angemessene Wachstumsraten zu gewährleisten.</li>
	<li>Keimzellen für die Lamininstimulation bei 10.500 Zellen/cm2 in Well-Platten oder Deckglasböden und Kultur für 2 Tage, wobei DgKI-Zellen zur Erzeugung fraktaler Ln1- und DgKO-Zellen als Negativkontrollen verwendet werden. Ln-1 vorsichtig über Nacht auf Eis im Kühlschrank auftauen und dann mit Induktionsmedium DMEM-F12 mischen, das mit 3 μg/ml Prolaktin, 2,8 μM Hydrocortison und 5 μg/ml Insulin ergänzt wird. Verwenden Sie für eine 35-mm-Schale 1 ml Induktionsmedium mit 50-800 μg Ln1.</li>
	<li>Wenn Sie fluoreszierendes Ln1 verwenden, mischen Sie es im Verhältnis 50:1 Gew./Gew.</li>
	<li>Entfernen Sie Medien aus den Zellen und bedecken Sie sie mit Laminin und Induktionsmedien von DMEM-F12, ergänzt mit 3 μg/ml Prolaktin, 2,8 μM Hydrocortison und 5 μg/ml Insulin</li>
	<li>Kultivieren Sie die Zellen 2 Tage lang und fixieren Sie sie dann mit 10% Formalin.</li>
</ol>5. Charakterisierung der Laminin-Mikrostruktur mittels optischer Mikroskopie
<ol><li>Fixierte Proben sammeln und 3 mal mit 1x PBS bei Raumtemperatur für 5 min waschen.</li>
	<li>Proben in 1x PBS mit 0,5 % Triton X-100, 3 % Rinderserumalbumin, 10 % Ziegenserum und 40 μg/ml Anti-Maus-blockierendem Antikörperfragment für 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer blockieren und permeabilisieren. HINWEIS: Triton X-100 ist gefährlich. Mit Handschuhen und Augenschutz anfassen und fachgerecht entsorgen.</li>
	<li>Anti-Laminin-Antikörper in einer Verdünnung von 1:100 mit 1x PBS mit 0,5 % Triton X-100 und 3 % BSA mischen und 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer zu den Proben geben (normalerweise Tip-Boxen mit einem feuchten Labortuch am Boden verwenden).</li>
	<li>Primären Antikörper entfernen und 3 mal mit 1x PBS mit 0,5% Triton X-100 und 3% BSA waschen.</li>
	<li>Proben in 1x PBS mit 0,5 % Triton X-100 und 3 % BSA einen geeigneten Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:500 zugeben und bei Raumtemperatur im Dunkeln in einer befeuchteten Kammer inkubieren.</li>
	<li>Sekundärantikörper entfernen und 3 mal mit 1x PBS mit 0,5% Triton X-100 und 3% BSA waschen.</li>
	<li>Bei Proben, die Zellen enthalten, fügen Sie 6 μM Phalloidin für 45 Minuten hinzu, gefolgt von 3 Waschungen mit PBS mit 0,5 % Triton X-100 und 3 % BSA und gefolgt von 3 Waschgängen mit PBS. Anschließend 5 Minuten lang mit 0,1 μg/ml DAPI in PBS färben.</li>
	<li>Montieren Sie gegebenenfalls Proben.</li>
	<li>Abbildung der ln-1-Struktur mit hochauflösender konfokaler Mikroskopie. Verwenden Sie ein Laser-Scanning-Mikroskop, das mit Immersionsobjektiven ausgestattet ist (Wasserimmersion Plan Apochromat 40X/1.1NA oder Ölimmersion Plan Apochromat 63X/1.4NA).</li>
</ol>6. Charakterisierung von Lamininkonstrukten über die Kistenzähldimension
<ol><li>Analysieren Sie fraktale Eigenschaften mit Box-Zähldimensionsalgorithmen, die in Matlab-Toolboxen oder in ImageJ verfügbar sind. Diese Methoden erzeugen Schwellenwertbilder von Laminin und zeichnen auf einem Log-Log-Diagramm die Anzahl der Kisten, die Ln1 enthalten, im Vergleich zur Größe der Kisten. Die Steigung der Beziehung zwischen diesen Parametern ist die Box-Zähldimension: Nicht-fraktale Geometrien haben eine Dimension von 0, 1 oder 2, während fraktale Geometrien eine nicht-ganzzahlige Dimension28 haben. HINWEIS: Säurebehandeltes, Glykoprotein-behandeltes und DgKI-Zell-gebundenes Ln1 haben alle eine fraktale Dimension von ~1,7, während Kontroll-Ln1 eine fraktale Dimension von 2,0 hat.</li>
</ol>7. Charakterisierung von Lamininkonstrukten mittels Elektronenmikroskopie
<ol><li>Resuspendieren Sie die Laminine in Zellkulturmedien und lassen Sie sie 90 Minuten lang in einer feuchten Umgebung von 37 °C an Siliziumdioxidwafern adsorbieren.</li>
	<li>Matrizen in 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer bei pH 7,2 fixieren. HINWEIS: Glutaraldehyd ist gefährlich und sollte in einem Abzug mit Handschuhen und Augenschutz gehandhabt und als Sondermüll entsorgt werden.</li>
	<li>Postfix-Matrizen in 1 % Osmiumtetroxid in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer bei pH 7,2. Anmerkungen: Osmiumtetroxid ist gefährlich und sollte in einem Abzug mit Handschuhen und Augenschutz gehandhabt und ordnungsgemäß entsorgt werden. Cacodylat ist gefährlich und sollte in einem Abzug mit Handschuhen und Augenschutz gehandhabt und ordnungsgemäß entsorgt werden.</li>
	<li>3 Mal in Natriumcacodylatpuffer bei pH 7,2 waschen.</li>
	<li>Dehydrieren Sie mit steigenden Ethanolkonzentrationen.</li>
	<li>Sputtern Sie Matrizen mit einer dünnen Goldschicht.</li>
	<li>Aufnahme mit Rasterelektronenmikroskopie.</li>
</ol>

<ol>
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K., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laminin+fragment+E4+inhibition+studies:+basement+membrane+assembly+and+embryonic+lung+epithelial+cell+polarization+requires+laminin+polymerization.">Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization.</a> International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).</li><li>Colognato, H., Yurchenco, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Form+and+function:+the+laminin+family+of+heterotrimers.">Form and function: the laminin family of heterotrimers.</a> Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).</li><li>Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. 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Diese Arbeit wurde unter der Schirmherrschaft des US-Energieministeriums vom Lawrence Livermore National Laboratory unter dem Vertrag DE-AC52-07NA27344 durchgeführt. IM-Freigabe LLNL-JRNL-799443.

Laminine stellen ein Schlüsselelement der EZM in epithelialen, muskulären und neuronalen Organsystemen dar und spielen in vitro eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der funktionellen Differenzierung von Zellen. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Struktur von Laminin, die den Zellen gezeigt wird, seine Signalübertragung und den daraus resultierenden Zellphänotypreguliert 15,16, so dass Methoden zur Kontrolle der Ln1-Mikrostruktur für Grundlagenbiologen, die auf diesen Gebieten arbeiten, und für Gewebeingenieure, die normales Verhalten in vitro rekapitulieren wollen, von Interesse sein sollten. Generell ist bekannt, dass die Mikrostruktur einer Vielzahl von extrazellulären Matrixproteinen die biologische Reaktion reguliert, und das Verständnis der Mechanismen, durch die die Mikrostruktur die Zellfunktion moduliert, ist ein aktives Forschungsgebiet.
In dieser Arbeit beschreiben wir drei Methoden zur Polymerisation von Laminin in Netzwerke mit fraktaler Mikrostruktur, die für diffusionsbegrenzte Aggregation charakteristisch sind. Es wurde gezeigt, dass diese Ln1-Polymere im Vergleich zu aggregiertem Ln1 anders an Zellen signalisieren, möglicherweise aufgrund einer veränderten Anzeige der adhäsiven Domäne für Zellen. Diese drei Methoden zur Kontrolle der Ln1-Mikrostruktur können eine biologische Redundanz beim Assemblieren von Ln1 darstellen, aber dies stellt eine Herausforderung für experimentelle Arbeiten dar. Die Kontrolle der Ln1-Mikrostruktur mit saurer Pufferbehandlung zeigt nur Wirkungen, wenn sie zu Dystroglykan-Knockout-Zellen hinzugefügt wird19,20. Daher muss das Versuchsdesign die zu verwendenden Zellen und die Reinheit von Ln1 berücksichtigen. Im Handel erhältliches Ln1 wird üblicherweise aus der EHS-Matrix gewonnen, die einen hohen Prozentsatz an Nidogenen und anderen Glykoproteinen enthält; Ln1 in der EHS-Matrix polymerisiert korrekt zu fraktalen Netzwerken in neutral gepufferten Systemen. Rekombinantes Ln1 ist seit kurzem kommerziell erhältlich, aber außergewöhnlich teuer.
Die Qualität des Ln1-Proteins ist für diese Arbeit von entscheidender Bedeutung, da kurze Armfragmente die Polymerisation blockieren können. Kurze Armfragmente (d. h. das E4-Fragment) stören die Netzwerkbildung, da jedes Fragment eine Lücke im Netzwerkinduziert 29. Frühere Daten zeigen, dass der Einschluss von E4-Fragmenten Ln1-induzierte Phänotypen blockieren kann29,30. Ebenso haben wir festgestellt, dass die Netzwerkbildung durch kleine Mengen von Laminin-332 gestört wird (unveröffentlichte Daten), das wie E4-Fragmente eine einzige adhäsive Domäne29,30 enthält. Daher ist es wichtig, vor Beginn der Arbeiten zu überprüfen, ob Ln1 intakt und hochgereinigt ist, um andere Lamininspezies zu entfernen.
Während diese Methoden für Forscher relevant sind, die Zell-Matrix-Wechselwirkungen untersuchen, sollte beachtet werden, dass die Laminin-Familie sehr komplex ist, 15 bekannte Mitglieder und zusätzliche Spleißvariantenumfasst 31, und diese Familie interagiert mit einer Vielzahl von Rezeptoren, Glykoproteinen, Kollagenen und möglicherweise Wachstumsfaktoren4. Somit stellt polymerisiertes Ln1 einen reduktionistischen Zustand dar, von dem erwartet werden kann, dass er durch die Zellfunktion schnell modifiziert wird. Darüber hinaus empfinden, reagieren und bauen verschiedene Organsysteme Laminine unterschiedlich um: Wir haben gezeigt, dass die Bindung von Laminin an Aktin durch Dystroglykan für die Brustdrüse entbehrlich ist19, während Dystroglykan für die Myozytenfunktion absolut notwendig ist32.

Im Gegensatz zu Wachstumsfaktoren oder Zytokinen können sich Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) zu strukturellen Netzwerken zusammensetzen. Da die EZM-Dysfunktion ein Schlüsselelement vieler Krankheitszustände ist, sind die Mechanismen, mit denen Zellen Signale aus der Zusammensetzung, Mikrostruktur und Biomechanik der EZM wahrnehmen und weiterleiten, attraktive Ziele für die therapeutische Entwicklung. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Mikrostruktur dieser Netzwerke eine wichtige Rolle dabei spielt, wie diese Proteine an die Zellen signalisieren. Bisher wurde dieser Zusammenhang zwischen EZM-Mikrostruktur und Zellfunktion für Kollagen I1, Fibronektin2 und Fibrin3 gezeigt.
Laminin-111 (Ln1) ist ein trimeres, kreuzförmiges Protein, das eine wichtige Strukturkomponente der extrazellulären Matrix ist, die Epithelzellen4, Muskelzellen5 und Nervenzellen6 kontaktiert. In der Brustdrüse ist Ln1 für die funktionelle Differenzierung von Brustdrüsenepithelzellen in milchproduzierende Zellen notwendig 7,8,9, und Ln1 ist entscheidend für die Induktion der Tumorreversion10,11. Ln1 und andere Laminine sind notwendig für die Entwicklung kortikaler Aktinnetzwerke und die Sarkolemma-Organisation im Muskel12,13 sowie für die Migration von Nervenzellen und das Wachstum von Neuriten13 . Daher ist das Verständnis der Mechanismen, durch die Laminin Signale an Zellen senden, ein aktives Forschungsgebiet.
Ln1 enthält mehrere adhäsive Domänen für ein breites Spektrum von Rezeptoren, darunter Integrine, Syndecane, Dystroglykan, LBP-110 und LamR (Abbildung 1A)4,14. Das E8-Fragment, das die c-terminus-globulären Domänen von Laminin α1 enthält, ist für die Bindung von Dystroglykan und Integrinen α6β1 und α3β115 und für die funktionelle Differenzierung von Epithelzellen notwendig15,16. Im Gegensatz dazu zeigen die kurzen Arme unterschiedliche biologische Aktivität17, was bedeutet, dass die Verfügbarkeit für die Erkennung dieser verschiedenen Ln1-Domänen nach Netzwerkbildung das Zellverhalten verändern könnte.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass Ln1, das in einem polymeren Netzwerk angeordnet ist, fraktale Eigenschaften aufweist (d.h. eine Struktur, die über mehrere Längenskalen hinweg selbstähnlich ist)18. Fraktale Netzwerke signalisieren Epithelzellen anders als Ln1, dem diese Anordnung fehlt19. Dieses fraktale Netzwerk weist auf eine bestimmte Assemblierungsstruktur hin, bei der der lange Arm bevorzugt den Zellen18 ausgesetzt ist. Infolge dieser unterschiedlichen Darstellung des langen Arms differenzieren sich Epithelzellen funktionell in milchproduzierende Zellen mit gut organisierten Tight Junctions und Unterdrückung von Aktin-Stressfasern19.
Wir beschreiben 3 Methoden zur Erzeugung von Ln1-Netzwerken aus Kurzarm-Kurzarm-Bindungsinteraktionen, die eine hohe Darstellung des Ln1-Langarms zeigen: 1) durch zellfreie Assemblierung mit sauren Puffern, 2) durch Co-Inkubation mit Glykoproteinen oder 3) durch Interaktion mit Zelloberflächendystroglykan. Diese drei Methoden erzeugen ähnliche Laminin-Mikrostrukturen durch drei sehr unterschiedliche Mechanismen, was Flexibilität bei der Versuchsplanung ermöglicht. Frühere Arbeiten deuten darauf hin, dass diese drei Methoden biologische Robustheit darstellen könnten: In Brustdrüsenepithelien können entweder Zelloberflächendystroglykan, Glykoproteine oder künstlich strukturiertes Laminin eine funktionelle Differenzierung induzieren19. So können die Forscher je nach Studienobjekt zwischen diesen Methoden wählen: Dystroglykan-exprimierende Zellen zeigen keine Empfindlichkeit gegenüber der Ln-1-Mikrostruktur, da Dystroglykan in der Zellmembran eine korrekte Polymerisation zu einem fraktalen Netzwerk induziert19,20. Matrigel, eine Mischung aus Lamininen und Glykoproteinen21, stellt die wirtschaftlichste Quelle für Ln-1 dar und bietet die notwendige Mikrostruktur, um dystroglykanische Knockout-Brustzellen zur Differenzierung zu veranlassen20, enthält jedoch eine komplexe Mischung von Proteinen mit Chargenvariabilität. PolyLM stellt das sauberste und reduktionistischste System dar, das diese Funktion bietet, jedoch zu höheren Kosten und einer geringeren Wirksamkeit bei der Induktion der Differenzierung von Brustzellen im Vergleich zu Matrigel19.
Diese drei Methoden haben eine fraktale Netzwerkstruktur, die für diffusionsbegrenzte Aggregation charakteristisch ist18,19 und zeigen eine veränderte biologische Aktivität im Vergleich zu aggregiertem Laminin in mehreren experimentellen Systemen 22,23,24,25. Zukünftige Studien mit diesen Methoden könnten die Rezeptoren und Signale identifizieren, die für die epitheliale Differenzierung erforderlich sind, und bestimmen, wie normale Zell-Matrix-Interaktionen in Zellen in abnormalen Mikroumgebungen20, wie z. B. Tumoren, wiederhergestellt werden können.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:665px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10% formalin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">HT501128</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-Laminin primary antibody</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody</td>
			<td style="width:121px;">Thermo</td>
			<td style="width:161px;">A32731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C4901 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td style="width:121px;">Thermo</td>
			<td style="width:161px;">Heracell 150 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge for microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:121px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:161px;">5418 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:121px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">LSM 710 or equivalent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coverslips</td>
			<td style="width:121px;">Thermo</td>
			<td style="width:161px;">25CIR-1 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Thermo</td>
			<td style="width:161px;">11330107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGF (Epidermal Growth Factor)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">11376454001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluorescently Labeled Laminin</td>
			<td style="width:121px;">Cytoskeleton Inc</td>
			<td style="width:161px;">LMN02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">VWRV0304-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HCl</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">320331 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">H0888-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">16634-50mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MepG Dystroglycan Knockout Cells</td>
			<td style="width:121px;">LBNL</td>
			<td style="width:161px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaOH</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S8045 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Normocin</td>
			<td style="width:121px;">Invivogen</td>
			<td style="width:161px;">ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Osmium Tetroxide</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">75633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ovine Prolactin</td>
			<td style="width:121px;">Los Angeles Biomedical Research Institute</td>
			<td style="width:161px;">Ovine Pituitary Prolactin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:121px;">Thermo</td>
			<td style="width:161px;">A22287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:121px;">Thermo</td>
			<td style="width:161px;">10010023 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Purified Laminin-111</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">L2020-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Recombinant human Nidogen-1, carrier free</td>
			<td style="width:121px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:161px;">2570-ND-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">S2889 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Cacodylate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">C0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile filters</td>
			<td style="width:121px;">Millipore</td>
			<td style="width:161px;">SLGP033RS or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris</td>
			<td style="width:121px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">252859 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-low protein binding tubes</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">76322-516, 76322-522 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ultrapure water</td>
			<td style="width:121px;">Thermo</td>
			<td style="width:161px;">15230253 or similar</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating a fractal microstructure of laminin-111 to signal to cells

Laminin-111 (Ln1) ist ein wesentlicher Bestandteil der extrazellulären Matrix in Epithelien, Muskeln und Nervensystemen. Wir haben bereits gezeigt, dass die Mikrostruktur von Ln1 die Art und Weise verändert, wie es an Zellen signalisiert, möglicherweise weil die Anordnung von Ln1 zu Netzwerken verschiedene adhäsive Domänen freilegt. In diesem Protokoll beschreiben wir drei Methoden zur Erzeugung von polymerisiertem Ln1.

Laminin-111 ist ein trimeres Protein mit drei selbstorganisierenden Domänen am Ende seiner kurzen Arme (Abbildung 1A). Bei geeigneter Behandlung können die kurzen Arme zu einem hexagonalen Gitter polymerisieren (Abbildung 1B,1C), das diffusionsbegrenzte Aggregatfraktaleigenschaften auf größeren räumlichen Skalen aufweist (Abbildung 2). Laminin, das in kalziumhaltigen Puffern mit neutralem pH-Wert inkubiert wird, bildet kleine Aggregate, die mit einem Anti-Ln1-Antikörper (Abbildung 2A) visualisiert werden und eine fraktale Dimension von ~2 haben, was auf keine Fraktalität hinweist. Im Gegensatz dazu bildet Ln1, das in einem kalziumhaltigen pH4-Puffer (Abbildung 2B) oder in neutralem Puffer mit Nidogen-1 (Abbildung 2C) inkubiert wird, raumfüllende Spitzennetzwerke mit einer fraktalen Dimension von ~1,7 (Abbildung 3). Ln1, kultiviert mit Dystroglykan-exprimierenden Zellen, bildet ähnliche Spitzennetzwerke (Abbildung 2D, Einschub zeigt Zellkerne).
Wenn pH7Ln und polyLM mit zunehmender Auflösung mit REM abgebildet werden, werden die Unterschiede in der Mikrostruktur deutlicher. Bei niedriger Auflösung (Abbildung 2Ei und v) erscheinen PolyLM-Netzwerke im Vergleich zu pH7-Ln stärker gestreut, und bei hoher Auflösung sind pH7-Ln-Aggregate sichtbar (Abbildung 2E iv), während bei PolyLM bei hoher Auflösung ein gespreiztes hexagonales Gitter zu sehen ist (Abbildung 2E viii).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61134/61134fig1.jpg"> Abbildung 1: Hintergrund von Ln1 und Polymerisationsverfahren: A: Ln1 ist ein komplexes trimeres Protein mit mehreren adhäsiven Domänen (Rezeptorbindungsstellen notiert), das eine Vielzahl von Integrin- und Nicht-Integrin-Rezeptoren (in schwarz) binden und polymere Netzwerke durch Kurzarm-Kurzarm-Bindung (in Tan) bilden kann. B: Ln1 kann in Gegenwart von Calciumionen und entweder niedrigem pH-Wert, Glykoproteinen wie Nidogen-1 oder Zelloberflächen-Dystroglykan ein hexagonales Gitter bilden. C: Beispiel für ein REM-Bild von polymerisiertem Ln1 mit hexagonalem Gitter und vorgeschlagenem Ln1-Assemblierungsmodell. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61134/61134fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61134/61134fig2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Daten für die Ln1-Polymerisation. A: Ln1 aggregiert in neutralen Puffern mit Kalzium. Bei Visualisierung mit einem Anti-Ln1-Antikörper sind kleine Aggregate zu sehen. B: Ln1 in saurem Calcium-haltigem Puffer polymerisiert zu PolyLM, das fraktale Eigenschaften aufweist. C: Ln1-Nidogen-1-Gemisch (1:1 Gew./Gew.) bildet ähnliche Polymere. D: Ln1 in neutral gepufferten Zellkulturmedien, die auf Dystroglykan-exprimierenden Zellen überlagert sind, zeigt ein ähnliches Spitzennetzwerk. Einschub: Kerngegenfärbung mit Zellmorphologie. E: Rasterelektronenmikroskopie von pH7-Ln- und PolyLM-Netzwerken (Spin-Down-Methode) mit zunehmender Auflösung. Bei pH7-Ln zeigen niedrig aufgelöste Scans (i & ii) relativ kompakte Fasern, die sich in hochauflösenden Scans als Aggregate auflösen (iii). polyLM ist bei gleicher Konzentration viel stärker gestreut (iv&v), und hochauflösende Scans zeigen ein hexagonales, raumfüllendes Gitter (vii). F: Diese mikrostrukturelle Veränderung führt dazu, dass sich DgKO-Brustdrüsenepithelzellen funktionell zu milchproduzierenden Zellen differenzieren19. i: pH7-Ln-stimulierte Zellen zeigen reichlich Aktin-Stressfasern (rot) und unorganisiertes Zo-1 mit Tight Junctions (grün), während ii: PolyLM-stimulierte Zellen weniger filamentöses Aktin, laterale Lokalisierung von Aktin in der Zell-Zell-Grenze und gut organisiertes Zo-1 mit Tight Junctions enthalten. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61134/61134fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61134/61134fig3.jpg"> Abbildung 3: Fraktale Dimensionsschätzung mit der Kistenzählmethode. A&B: Rohbilder von pH7-Ln und PolyLM zeigen Unterschiede in der Morphologie. C&D: Diese Bilder werden auf einen Schwellenwert festgelegt, um ein Schwarzweißbild zu erhalten, E&F: Dann wird der Logarithmus des Verhältnisses zwischen der Anzahl der Kästchen, die das Bild enthalten, und der Größe des Kastens berechnet. Die durchschnittliche Steigung stellt die Kistenzähldimension dar, die Fd berechnet wird. pH7-Ln hat eine charakteristische Dimension von 2,0, was auf keine fraktalen Eigenschaften hinweist, während polyLM eine Dimension von ~1,7 hat, was auf einen diffusionsbegrenzten Aggregationsprozess hinweist. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61134/61134fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Generating a Fractal Microstructure of Laminin-111 to Signal to Cells

Wir beschreiben drei Methoden zur Erzeugung von Ln1-Polymeren mit fraktalen Eigenschaften, die den Zellen anders signalisieren als unpolymerisiertes Ln1.

Erzeugung einer fraktalen Mikrostruktur von Laminin-111 als Signal an Zellen

Laminin-111 (Ln1) is an essential part of the extracellular matrix in epithelia, muscle and neural systems. We have previously demonstrated that the ...

generating-a-fractal-microstructure-of-laminin-111-to-signal-to-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

920 Aufrufe.  Texas Heart Institute. Wir beschreiben drei Methoden zur Erzeugung von Ln1-Polymeren mit fraktalen Eigenschaften, die den Zellen anders signalisieren als unpolymerisiertes Ln1.

Serie: Generating a Fractal Microstructure of Laminin-111 to Signal to Cells

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Forschung

Biotechnik

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper tissue penetration. However, the existing instrumentation on the market is not readily compatible with upconversion application. Therefore, modifying the commercially available instrument is essential for this research. In this paper, we first illustrate the modifications of a conventional fluorimeter and fluorescence microscope to make them compatible for photon upconversion experiments. We then describe the synthesis of a near-infrared (NIR)-triggered caged protein kinase A catalytic subunit (PKA) immobilized on a UCNP complex. Parameters for microinjection and NIR photoactivation procedures are also reported. After the caged PKA-UCNP is microinjected into REF52 fibroblast cells, the NIR irradiation, which is significantly superior to conventional UV irradiation, efficiently triggers the PKA signal transduction pathway in living cells. In addition, positive and negative control experiments confirm that the PKA-induced pathway leading to the disintegration of stress fibers is specifically triggered by NIR irradiation. Thus, the use of protein-modified UCNP provides an innovative approach to remotely control light-modulated cellular experiments, in which direct exposure to UV light must be avoided.

In this protocol, caged protein kinase A (PKA), a cellular signal transduction bioeffector, was immobilized on a nanoparticle surface, microinjected into the cytosol, and activated by the upconverted UV light from near-infrared (NIR) irradiation, inducing downstream stress fiber disintegration in the cytosol.

Ein integriertes System aus der Ferne intrazelluläre Signaltransduktion von Großbildschirmen Nanoparticle vermittelte Kinase Photoaktivierungen auslösen

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper ...

Calorespirometry: A Powerful, Noninvasive Approach to Investigate Cellular Energy Metabolism

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic respiration. However, the extent to which both pathways contribute to the landscape of cellular energy production is consistently overlooked. Transformed cells cultured in saturating levels of glucose often show a decreased dependency on oxidative phosphorylation for ATP production, which is compensated by an increase in substrate-level phosphorylation. This shift in metabolic poise allows cells to proliferate despite the presence of mitochondrial toxins. In neglecting the altered metabolic poise of transformed cells, results from a pharmaceutical screening may be misinterpreted since the potentially mitotoxic effects may not be detected using model cell lines cultured in the presence of high glucose concentrations. This protocol describes the pairing of two powerful techniques, respirometry and calorimetry, which allows for the quantitative and noninvasive assessment of both aerobic and anaerobic contributions to cellular ATP production. Both aerobic and anaerobic respirations generate heat, which can be monitored via calorimetry. Meanwhile, measuring the rate of oxygen consumption can assess the extent of aerobic respiration. When both heat dissipation and oxygen consumption are measured simultaneously, the calorespirometric ratio can be determined. The experimentally obtained value can then be compared to the theoretical oxycaloric equivalent and the extent of the anaerobic respiration can be judged. Thus, calorespirometry provides a unique method to analyze a wide range of biological questions, including drug development, microbial growth, and fundamental bioenergetics under both normoxic and hypoxic conditions.

This protocol describes calorespirometry, the direct and simultaneous measurement of both heat dissipation and respiration, which provides a noninvasive approach to assess energy metabolism. This technique is used to assess the contribution of both aerobic and anaerobic pathways to energy utilization by monitoring the total cellular energy flow.

Calorespirometry: Eine starke, nicht-invasive Ansatz zur zellulären Energiestoffwechsel untersuchen

Many cell lines used in basic biological and biomedical research maintain energy homeostasis through a combination of both aerobic and anaerobic ...

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate flow chambers. Endothelial cells form the inner cellular lining of blood vessels and are chronically exposed to the frictional force of blood flow called shear stress. Under physiological conditions, endothelial cells function in the presence of various shear stress conditions. Thus, the application of shear stress conditions in in vitro models can provide greater insight into endothelial responses in vivo. The parallel-plate flow chamber previously published by Lane et al.9 is adapted to study endothelial gene regulation in the presence and absence of steady (non-pulsatile) laminar flow. Key adaptations in the set-up for laminar flow as presented here include a large, dedicated environment to house concurrent flow circuits, the monitoring of flow rates in real-time, and the inclusion of an exogenous reference RNA for the normalization of quantitative real-time PCR data. To assess multiple treatments/conditions with the application of shear stress, multiple flow circuits and pumps are used simultaneously within the same heated and humidified incubator. The flow rate of each flow circuit is measured continuously in real-time to standardize shear stress conditions throughout the experiments. Because these experiments have multiple conditions, we also use an exogenous reference RNA that is spiked-in at the time of RNA extraction for the normalization of RNA extraction and first-strand cDNA synthesis efficiencies. These steps minimize the variability between samples. This strategy is employed in our pipeline for the gene expression analysis with shear stress experiments using the parallel-plate flow chamber, but parts of this strategy, such as the exogenous reference RNA spike-in, can easily and cost-effectively be used for other applications.

Here, a workflow for the culture and gene expression analysis of endothelial cells under fluid shear stress is presented. Included is a physical arrangement for simultaneously housing and monitoring multiple flow chambers in a controlled environment and the use of an exogenous reference RNA for quantitative PCR.

Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen ausgesetzt um Stress mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern Scheren

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the microscale&#8213;to create micro-environments for microbial chemotaxis experiments. To create chemical pulses, we developed a system to introduce amino acid sources near-instantaneously by photolysis of caged amino acids within a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chamber containing a bacterial suspension. We applied this method to the chemotactic bacterium, Vibrio ordalii, which can actively climb these dynamic chemical gradients while being tracked by video microscopy. Amino acids, rendered biologically inert (&#39;caged&#39;) by chemical modification with a photoremovable protecting group, are uniformly present in the suspension but not available for consumption until their sudden release, which occurs at user-defined points in time and space by means of a near-UV-A focused LED beam. The number of molecules released in the pulse can be determined by a calibration relationship between exposure time and uncaging fraction, where the absorption spectrum after photolysis is characterized by using UV-Vis spectroscopy. A nanoporous polycarbonate (PCTE) membrane can be integrated into the microfluidic device to allow the continuous removal by flow of the uncaged compounds and the spent media. A strong, irreversible bond between the PCTE membrane and the PDMS microfluidic structure is achieved by coating the membrane with a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) followed by plasma activation of the surfaces to be bonded. A computer-controlled system can generate user-defined sequences of pulses at different locations and with different intensities, so as to create resource landscapes with prescribed spatial and temporal variability. In each chemical landscape, the dynamics of bacterial movement at the individual scale and their accumulation at the population level can be obtained, thereby allowing the quantification of chemotactic performance and its effects on bacterial aggregations in ecologically relevant environments.

A protocol for the generation of dynamic chemical landscapes by photolysis within microfluidic and millifluidic setups is presented. This methodology is suitable to study diverse biological processes, including the motile behavior, nutrient uptake, or adaptation to chemicals of microorganisms, both at the single cell and population level.

Generieren kontrollierter, dynamischer chemischer Landschaften zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

Biomimetische Replikation der Wurzeloberflächen-Mikrostruktur mit Änderung der weichen Lithographie

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...