Dieses Protokoll hilft uns zu verstehen, wie Microtubule Cytoskelett Verhalten in Pflanzen auftritt. Gleichzeitig hilft es uns zu verstehen, wie diese strukturellen Komponenten, die die Zell- und Organform beeinflussen, auf Veränderungen der mechanischen Kräfte reagieren. Obwohl diese Methode wenig Raffinesse erfordert, bietet sie robustes, quantitatives Nachlesen, die mechanischen Reaktionsunterschiede zwischen verschiedenen Genotypen und Bedingungen.
Beginnen Sie mit dem Anbau von Arabidopsis-Samen, die Mikrotubuli-Bindungsdomänen ausdrücken, die mit grünem fluoreszierendem Protein im Boden verschmolzen sind, bei 20 und 6 Grad Celsius unter langen Tagesbedingungen für eine Woche. Nach der Keimung die Sämlinge in neue Töpfe mit ausreichend Wachstumsraum geben, um ein robustes vegetatives Wachstum zu ermöglichen, und stellen Sie die Pflanzen bei 20 und 16 Grad Celsius unter kurzen Tagesbedingungen. Nach drei bis fünf Wochen die Pflanzen bei gleicher Temperatur auf lange Tagesbedingungen zurückübertragen, bis die Pflanzen schrauben, so dass der Blütenstand bis zu zwei bis fünf Zentimeter lang wird.
Für Shoot Apical Meristem Sezieren, put den Blütenstand, und verwenden scharfe Zange, um die Blumen an der Basis der Pedunkeln zu schälen, bis es schwierig ist, die Peunkel mit dem bloßen Auge zu sehen, um die älteren Blütenknospen zu entfernen. Verwenden Sie die Zange, um einen Schlitz in den Agros in einer Sezschale zu erstellen, und pflanzen Sie die Blütenstandbasis in den dicken Augur. Legen Sie die Schale unter ein Sezieren des Mikroskops.
Beginnend mit der ältesten Blütenknospe, drücken Sie mit den Zangen, um die Blütenknospe aus der Pflanze zu entfernen. Das triebapikale Meristem wird in der Regel ausgesetzt, wenn ältere Blüten bis Stufe sechs bis sieben entfernt werden. Und verwenden Sie die Zange, um jede Blütenknospe nach unten zu drücken, bis das Schießen apikalen Meristem sichtbar ist.
Sobald der Trieb-Apikale Meristem freigelegt ist, lassen Sie die frisch sezierte Probe im Wachstumsmedium in einer Ethanol-sterilisierten rechteckigen Kunststoff-Scharnierkulturbox mit dem Trieb-Apischen Meristem nur über der mittleren Oberfläche freisetzen. Fügen Sie ein paar Tropfen sterilen entionisierten Wassers an die Ränder der Kulturbox und schließen Sie den Deckel, um die Feuchtigkeit in der Box zu erhalten. Wickeln Sie die Box mit Mikroporenband, und legen Sie die Wachstumsbox unter langen oder durchgehenden Tagesbedingungen bei 22 Grad Celsius für 12 bis 24 Stunden.
Wenn sich die Pflanze vom Sezierverfahren erholt hat, bedecken Sie die Probe mit sterilem entionisiertem Wasser und überprüfen Sie luftblasen unter dem Seziermikroskop. Übertragen Sie die Kulturbox auf eine aufrechte konfokale Mikroskopstufe, und wählen Sie die 40- oder 60-fache Wassertauchlinse aus. Senken Sie das Objektiv ins Wasser und überprüfen Sie auf Luftblasen auf der Vorderseite des Objekts.
Um Blasen zu entfernen, senken Sie die Bühne und wischen Sie die Linse vorsichtig mit einem optischen Gewebe ab. Verwenden Sie dann eine Pasteur-Pipette, um der Vorderen Linse des Objektivs ein kleines Wasservolumen hinzuzufügen, bevor Sie die Linse wieder ins Wasser tauchen. Verwenden Sie als Nächstes den GFP-Filter und das Epi-Beleuchtungsmodul des konfokalen Mikroskops, um den XY-Controller anzupassen, um die Probe zu lokalisieren.
Die Position des Okulars anpassen, den Trieb-Apischen Meristem direkt unter der Lichtquelle positionieren und entlang der Z-Achse fokussieren, bis sich der Scheitelpunkt befindet. Verwenden Sie einen Laser, der in der Lage ist, die Probe zu verspannenden, um die Probe zu beleuchten, und passen Sie den optischen Zoom des Mikroskops so an, dass sich das gesamte Trieb-Apisches Meristem und die Bühne eins floraler Primordie im Sichtfeld befinden. Passen Sie dann die Leistung des Laserausgangs und die Gain-Einstellungen an, um ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.
Nachdem Sie die Probe für zwei bis fünf Minuten absetzen konnten, erfassen Sie konfokale Z-Stacks der Probe in 0,25 bis 0,5 Mikrometern Z-Slice-Intervallen, wodurch eine Pixelauflösung von etwa 0,3 Mikrometern hinzugefügt wird. Am Ende der Akquisition sofort das Wasser entfernen und die Kulturbox zurück in die Wachstumskammer übertragen. Für mikromechanische spiratische Meristem-Perturbation, erwerben Sie Pre-Ablation Bildstapel der kortikalen Mikrotubuli-Organisation, wie gerade gezeigt, und decaf das Wasser aus der Kultur-Box in eine Kulturschale.
Übertragen Sie den Triebapikalst unter einem Sezierendes Mikroskop und nähern Sie sich langsam dem triebapikalen Meristem mit einer sauberen 0,4 mal 20-Millimeter-Spritzennadel. Berühren Sie kurz die Peripherie der Kuppel des Trieb-Apischen Meristem mit der Nadelspitze, um zu bestätigen, dass die Ablation abgeschlossen ist. Und füllen Sie das Kulturgericht mit sterilem entionisiertem Wasser.
Dann fügen Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid in die Schale und erfassen Sie sofort Bildstapel, wie alle zwei Stunden für sechs Stunden gezeigt, wodurch das Kulturgericht zwischen jedem Zeitpunkt zur Inkubation zurückkehrt. Für die Datenanalyse können Sie Oberflächenprojektionen der Bildstapel mit einem geeigneten Bildanalyse-Softwareprogramm generieren und die Extraktion der kortikalen Mikrotubuli-Anisotropie mit dem Fibril Tool Macro in Fidschi durchführen. Hier können typische Projektionsbilder aus Mikrotubuli-Bindungsdomänen-GFP-Linien mit Zellen in der Mitte der Kuppel beobachtet werden, die unorganisierte kortikale Mikrotubuli, Zellen an der Peripherie, mit einer Umfangsverteilung und Grenzdomänenzellen enthalten, die kortikale Mikrotubuli enthalten, die parallel zur langen Achse der Zelle ausgerichtet sind.
Zeitraffer-Bildgebung zeigt die kortikale Mikrotubuli-Ausrichtung, die sich innerhalb von sechs Stunden nach ablation von einem stark ungeordneten Array zu einem besser organisierten Array ändert. Tensoren könnten auf den kortikalen Mikrotubuli-Bildern überlagert werden, und die extrahierten Informationen könnten durch Plotten der mittleren Anisotropie im Laufe der Zeit dargestellt werden. Bei der Einstellung der Laserausgangsleistung und der Verstärkungseinstellungen sollten wir sicherstellen, dass die Filamente klar beobachtet werden, und versuchen, eine Überbelichtung zu vermeiden, da übergesättigte Signale die Zugrichtung in späteren Analysen verzerrt enzieren könnten.
Die Atomkraftmikroskopie kann auch durchgeführt werden, um zu beurteilen, wie sich die Veränderungen der mechanischen Kräfte tatsächlich auf den physischen Zustand der Zellwand auswirken.
