Dieses Protokoll beschreibt eine Kultur der fetalen Darmzellen der Maus, die am besten geeignet ist, eine Reifung im Erwachsenenstadium in vitro zu erreichen. Dieser In-vitro-Ansatz kann verwendet werden, um molekulare Mechanismen des Säugens-zu-Entwöhnungs-Übergangs sowie die Modulatoren dieses Prozesses zu untersuchen und eine effizientere Nutzung von Versuchstieren zu erreichen. Für dieses In-vitro-Modell der Darmreifung ist es wichtig, primäre Darmzellen aus dem späten Entwicklungsstadium zwischen dem 18. und 20. Embryonaltag zu verwenden.
Mit zwei kleinen Zangen, dehnen Sie den Darm. Mit dem Magen und Blinddarm als Leitfäden, schneiden Sie die proximalen und distalen Teile des Dünndarms auseinander. Schneiden Sie den Doppelpunkt als Leitfaden auseinander.
Um den Darm längs offen zu machen, legen Sie eine Rasierklinge längs entlang des Darms und ziehen Sie den Darm durch Schieben von Zangen entlang der Rasierklinge. Anschließend den geöffneten Darm in einen Zentimeter schneiden. Bereiten Sie drei 50-Milliliter-Röhren mit zehn Millilitereisis PBS vor.
Übertragen Sie die proximalen und distalen Teile des Dünndarms und des Dickdarms getrennt in die Röhren. Halten Sie die Röhren auf Eis, während Sie den Darm zusätzlicher Mäuse sezieren. Sammeln Sie alle Darmteile eines Wurfs zusammen in der gleichen Röhre.
Nach dem Waschen der Darmstücke mit eiskaltem PBS 30 Minuten lang mit zwei Millimolaren EDTA bebrüten. Um Krypten vom Gewebe zu trennen, waschen Sie die Stücke teilweise mit eiskaltem PBS und zehn Prozent Kalbserum und filtern Sie durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein neues Rohr. Waschen Sie das Gewebe zwei weitere Male und kombinieren Sie die gefilterte Lösung.
Zentrifugieren Sie die gefilterte Lösung, die die Krypten bei 150 mal G enthält, für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die Krypten als Pellet zu sammeln. Übertragen Sie die Krypten wieder in ein 15-Milliliter-Rohr und eine Zentrifuge. Um Brunnen zu platten, fügen Sie die Gesamtmenge an extrazellulärem Matrixgel in das Rohr und lösen Sie das Pellet auf.
Fügen Sie 20 Mikroliter der gelösten Krypten in jeden Brunnen einer warmen 48-Well-Platte hinzu. Nach dem Beschichten des ersten Brunnens, schauen Sie unter dem Mikroskop, um die Dichte von etwa 250 bis 300 Krypten pro Brunnen zu bestätigen. Legen Sie die Platte zehn Minuten lang in einen 37 Grad Celsius Inkubator, um das extrazelluläre Matrixgel erstarren zu lassen.
Bereiten Sie dann ENR-Medium vor. 250 Mikroliter des ENR-Mediums in jeden Brunnen auf das Gel geben. Wechseln Sie das Medium dreimal pro Woche und Durchgang die Organoide einmal pro Woche.
Analysieren Sie die Kultur einen Monat lang alle drei Tage nach jeder Passage. Drei Tage nach jeder Passage, isolieren SIE RNA aus einem Brunnen durch Zugabe von 200 Mikroliter NRNA-Lysepuffer mit zwei Mikroliter Beta-Mercaptoethanol in den Brunnen ergänzt. Übertragen Sie dann die Probe aus dem Brunnen in ein RNAse-freies 1,5-Milliliter-Rohr.
In unseren In-vitro-Experimenten haben wir Dexamethoson als Beispiel für einen externen Faktor verwendet, der bekanntermaßen die Darmreifung in vivo beschleunigt. Um Protein zu isolieren, fügen Sie 250 Mikroliter eiskalte Zell-Wiederherstellungslösung pro Gut zu fünf Brunnen von Organoiden und sammeln sie alle in einem 15 Milliliter Tube. Mindestens 30 Minuten auf Eis inkubieren, um das extrazelluläre Matrixgel aufzulösen.
Mit eiskaltem PBS waschen, 250 Mikroliter Zelllysepuffer hinzufügen und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Um die Enzymaktivität zu analysieren, bereiten Sie zunächst 0,625 molaren Maleic Puffer bei pH sechs und 0,05 Molarenlösungen von Lactose, Saccharose, Maltose und Trehalase vor und lagern sie auf Eis. Bereiten Sie Assay-Standards vor, indem Sie 5,56 Molaren-Glukose-Lösung mit reinem reinem Wasser verdünnen, um Lösungen mit 5 verschiedenen Konzentrationen zu erhalten.
Dann, in eine 96-Well-Platte, fügen Sie acht verschiedene Gruppen von organoiden Lysat mit ihren jeweiligen Substraten einschließlich Standards und Kontrolle nach dem Manuskript. 60 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Um die Menge an Glukose zu bestimmen, die von den im organoiden Lysat vorhandenen Enzymen produziert wird, fügen Sie schnell 200 Mikroliter frisch zubereitete PGO-Farblösung hinzu und messen sie die Absorption auf dem Spektralphotometer bei 450 Nanometern alle fünf Minuten für dreißig Minuten bei 37 Grad Celsius.
In diesem Protokoll wurden proximale und distale Darm von E18 bis E20 Maus Föten isoliert. Bei der Isolierung wurden Epithelzellen in extrazellulären Matrix-Gelkuppeln gesät. Nach etwa 28 bis 30 Tagen Kultur wurden fetale Organoide in den reifen Erwachsenenzustand entwickelt.
Die proximalen Marker Onecut2 und Gata4 wurden hauptsächlich in der proximalen Organoidkultur ausgedrückt, während die distalen Marker Fabp6 und Guca2a hauptsächlich in der distalen Organoidkultur zum Ausdruck kamen. Fetale Marker Lactase, Ass1, Blimp-1 und neonatale Fc-Rezeptor in ihrer relativen Expression und erwachsene Marker sucrase isomaltase, Argenase 2, Trehalase und Lysozym im Laufe der Zeit in proximalen und distalen organoiden Kulturen erhöht. Die Auswirkungen von extrinsischen Faktoren sollten nicht unbedingt genomisch sein.
Die Genexpression des fetalen Markers Blimp-1 wurde an Tag 12 für die mit Dexamethason behandelten Organoide im Vergleich zu den Kontrollorganoiden verringert. Jedoch, sowohl Genexpression und Enzymaktivität der erwachsenen Marker Sucrase Isomaltase wurden erhöht. Bei der Verwendung dieses Protokolls ist es wichtig zu erkennen, dass nur späte fetale Stadium Organoide sind in der Lage, zu erwachsenen Organoiden in vitro zu übertragen.
Die Anzahl von sechs bis zehn Föten als Ausgangspunkt dieser Kultur kann weiter reduziert werden, indem der gesamte Darm verwendet wird, um die Gesamtreifung zu studieren. Der translationale Wert dieses Modells liegt in der Möglichkeit von extremen Effektoren mit hoher Gruppe, die in der Lage sind, die Darmreifung zu modulieren, die ein Prozess ist, der zwischen Säugetieren konserviert wird.
