يصف هذا البروتوكول ثقافة الخلايا المعوية الجنينية الماوس التي هي الأنسب لتحقيق النضج لمرحلة الكبار في المختبر. ويمكن استخدام هذا النهج في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية للانتقال من الرضاعة إلى فَفَت فضلا عن التضمينات لهذه العملية وتحقيق استخدام أكثر كفاءة للحيوانات التجريبية. من الضروري لهذا النموذج في المختبر من نضوج الأمعاء لاستخدام الخلايا المعوية الأولية من مرحلة النمو في وقت متأخر, بين يوم الجنين 18 و 20.
مع اثنين من ملقط صغيرة، وتمتد الأمعاء. باستخدام المعدة والتذييل كمرشدين، قطع أجزاء قريبة وهاتية من الأمعاء الدقيقة. باستخدام التذييل كدليل، وقطع القولون.
لجعل الأمعاء مفتوحة طوليا، ضع شفرة حلاقة بالطول على طول الأمعاء واسحب الأمعاء عن طريق انزلاق ملقط على طول شفرة الحلاقة. في وقت لاحق، وقطع الأمعاء المفتوحة إلى قطع سنتيمتر واحد. إعداد ثلاثة أنابيب 50 ملليلتر مع عشرة ملليلتر من الجليد البارد برنامج تلفزيوني.
نقل الأجزاء القريبة والهية من الأمعاء الدقيقة والقولون بشكل منفصل إلى الأنابيب. الحفاظ على أنابيب على الجليد أثناء تشريح الأمعاء من الفئران إضافية. جمع جميع أجزاء الأمعاء من القمامة واحد معا في نفس الأنبوب.
بعد غسل القطع المعوية مع الثلج البارد PBS ، احتضان مع اثنين من المليمولار EDTA لمدة 30 دقيقة. لفك السرداب من الأنسجة، وغسل جزئيا القطع مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة وعشرة في المئة مصل العجل وتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب جديد. كرر غسل الأنسجة مرتين إضافيتين والجمع بين محلول تمت تصفيتها.
الطرد المركزي الحل المصفاة التي تحتوي على ا سرداب في 150 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية لجمع سردابات ك بيليه. نقل السردابات إلى أنبوب 15 ملليلتر والطرد المركزي مرة أخرى. لوحة الآبار، إضافة المبلغ الإجمالي من هلام مصفوفة خارج الخلية اللازمة في أنبوب وحل بيليه.
إضافة 20 ميكرولترات من cry الذائبة في كل بئر من لوحة دافئة 48 جيدا. بعد طلاء البئر الأول ، انظر تحت المجهر لتأكيد كثافة حوالي 250 إلى 300 سرداب في البئر. ضع اللوحة في حاضنة درجة مئوية 37 لمدة عشر دقائق للسماح لـ مصفوفة هلامية خارج الخلية بترسخها.
ثم، إعداد متوسطة ENR. إضافة 250 ميكرولترات من المتوسط ENR في كل بئر على هلام. تغيير المتوسط ثلاث مرات في الأسبوع والمرور organoids مرة واحدة في الأسبوع.
لمدة شهر واحد، كل ثلاثة أيام بعد كل مرور، وتحليل الثقافة. بعد ثلاثة أيام من كل مرور، عزل الجيش الملكي النيبالي من بئر واحد بإضافة 200 ميكرولترات من العازلة تحلل RNA تكملها مع اثنين من microliters من بيتا mercaptoethanol إلى البئر. ثم، نقل العينة من البئر إلى أنبوب 1.5 ملليلتر خالية من RNAse.
في تجاربنا في المختبر، استخدمنا dexamethosone كمثال على عامل خارجي معروف لتسريع النضج المعوي في الجسم الحي. لعزل البروتين، إضافة 250 ميكرولترات من الجليد محلول استعادة الخلايا الباردة في بئر إلى خمسة آبار من organoids وجمع كل منهم في أنبوب 15 ملليلتر. احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل على الجليد لإذابة هلام المصفوفة خارج الخلية.
غسل مع برنامج تلفزيوني بارد الجليد، إضافة 250 ميكرولترات من العازلة تحلل الخلية، وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. لتحليل نشاط الإنزيم، قم أولاً بإعداد 0.625 عازلة مالية مُضجرة عند مستوى 6 و0.05 من محلولي المولر من اللاكتوز، السكروز، المالتوز، والتريهالاس وتخزينها على الجليد. إعداد معايير الفحص عن طريق تخفيف محلول الجلوكوز الزهر 5.56 مع المياه النقية للحصول على حلول مع 5 تركيزات مختلفة.
ثم، في لوحة 96 جيدا، إضافة ثماني مجموعات مختلفة من lysate organoid مع ركائز كل منها بما في ذلك المعايير والسيطرة وفقا للمخطوطة. احتضان لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية. لتحديد كمية الجلوكوز التي تنتجها الانزيمات الموجودة في lysate organoid، بسرعة إضافة 200 ميكرولترات من حل اللون PGO الطازجة وإعداد وقياس امتصاص على مقياس الطيفي في 450 نانومتر كل خمس دقائق لمدة ثلاثين دقيقة في 37 درجة مئوية.
في هذا البروتوكول، تم عزل الأمعاء القريبة والعزلة من جنين الماوس E18 إلى E20. عند العزل، كانت الخلايا الظهارية بذر في القباب هلام مصفوفة خارج الخلية. بعد ما يقرب من 28 إلى 30 يوما من الثقافة، وضعت organoids الجنين إلى الدولة ناضجة الكبار.
تم التعبير عن العلامات القريبة Onecut2 وGata4 بشكل رئيسي في الثقافة العضوية القريبة ، في حين تم التعبير عن العلامات البعيدة Fabp6 وGuca2a في الغالب في الثقافة العضوية البعيدة. انخفض الجنين علامات اللاكتوز، Ass1، المنطاد-1 ومستقبلات الوليد FC في التعبير النسبي وعلامات الكبار sucrase isomaltase، argenase 2، trehalase وlysozyme زيادة مع مرور الوقت في كل من الثقافات العضوية القريبة وهرج. ولا ينبغي بالضرورة أن تكون آثار العوامل الخارجية مُجينة.
انخفض التعبير الجيني لعلامة الجنين المنطاد-1 في اليوم 12 للعضويات المعالجة بالديساميثاسون مقارنة بالأعضاءية التحكمية. ومع ذلك، تم زيادة كل من التعبير الجيني ونشاط انزيم علامات الكبار sucrase isomaltase. عند استخدام هذا البروتوكول ، من المهم أن ندرك أن المرحلة المتأخرة فقط الجنينية المرحلة هي قادرة على العبور إلى organoids الكبار في المختبر.
ويمكن تخفيض عدد من ستة إلى عشرة أجنة كنقطة انطلاق لهذه الثقافة عن طريق استخدام الأمعاء كلها لدراسة النضج العام. القيمة الترجمية لهذا النموذج تكمن في إمكانية ارتفاع مجموعة extremes effectors قادرة على تحوير النضج المعوي الذي هو عملية حفظها بين الثدييات الممرض.
