Der Hauptvorteil unseres Genotypisierungsprotokolls besteht darin, dass es die Kontamination mit mütterlicher DNA minimiert, was die größte Herausforderung bei der Genotypisierung formalinfixierter, paraffineingebetteter Molarengewebe ist. Durchflusszytometrie ist eine schnelle und kostengünstige Methode, die die Diagnose von hydatidiformen Maulwürfen erheblich erleichtert. Für jedes formal fixierte Paraffin-eingebettete oder FFPE-Produkt der Empfängnis bereiten Sie einen vier Mikrometer dicken Hämatoxylin- und Eosin-Fleckenabschnitt vor, wie in diesem Video beschrieben, um die morphologische Auswertung durch Mikroskopie durchzuführen.
Stellen Sie die FFPE-Blöcke für 15 Minuten auf Eis, um den Schnitt zu erleichtern. Passen Sie das Mikrotome an Schnittabschnitte an, die für die mikroskopische morphologische Auswertung vier Mikrometer dick sind. Legen Sie den kalten Block in das Mikrotome und schneiden Sie einen Abschnitt aus jedem Block für H&E Färbung.
Mit Zangen, übertragen Sie jeden Abschnitt in ein 45 Grad Celsius Wasserbad. Nehmen Sie den Abschnitt aus dem Wasserbad mit einem positiv geladenen Dia, das zuvor mit der Proben-Identifikationsnummer beschriftet war, mit einem Bleistift. Legen Sie die Dias mit den Abschnitten bei 65 Grad Celsius in einen Ofen, damit die Abschnitte an den Dias haften können.
Halten Sie die Rutschen 25 Minuten im Ofen. Führen Sie die H&E-Färbung durch, indem Sie die Dias für den richtigen Zeitraum, wie im Textprotokoll aufgeführt, in die entsprechenden Färbegläser eintauchen. Montieren Sie die Vier-Mikron-Abschnitte für die morphologische Analyse mit Montagemedium.
Und Abdeckung mit Glasabdeckung rutscht. Wählen Sie mit den H&E-Dias und einem Lichtmikroskop den FFPE-Block aus, der die größte Menge an Chorionzotten enthält. Und wenn möglich, der Block, der Chorionzotten hat, trennen und nicht mit mütterlichem Gewebe vermischt.
Passen Sie das Mikrotome an, um Abschnitte zu schneiden, die 10 Mikrometer dick für die DNA-Extraktion sind. Schneiden Sie 10 bis 30 Abschnitte, abhängig von der Menge der Chorionzotten im Block. Nachdem Sie die Abschnitte wie zuvor mit Rutschen aufgenommen haben, legen Sie die Dias mit den Abschnitten in einem Ofen bei 65 Grad Celsius, damit die Abschnitte an den Dias haften können.
Halten Sie die Dias 20 Minuten im Ofen. Führen Sie die H&E-Färbung durch, indem Sie die Dias für den richtigen Zeitraum, wie im Textprotokoll aufgeführt, in die entsprechenden Färbegläser eintauchen. Lassen Sie die Dias mindestens drei Stunden unter der Dunstabzugshaube, damit sich die giftigen Xylolgerüche auflösen.
Mit Zangen ein winziges Stück Papier aus einem befeuchteten Papiertuch reißen. Verwenden Sie unter einem Licht-Stereomikroskop die Zangen und kleine Stücke von wasserbefeuchteten Papiertüchern, um alle unerwünschten mütterlichen Gewebe von H&E-Flecken 10-Mikron dicken Abschnitten abzukratzen. Der Schlüssel für diesen Schritt ist Geduld, vor allem für herausfordernde Blöcke.
Es ist auch wichtig, dass jemand anderes einen Blick darauf richtet, dass kein mütterliches Gewebe verpasst wird. Nun, reißen Sie ein neues Stück Papier aus den befeuchteten Papiertüchern und verwenden Sie es, um die Chorion-Zotten zu sammeln. Legen Sie die Stücke Papiertücher mit ihren beigefügten Chorionzotten in eine beschriftete 1,5 ml Tube.
Minimieren Sie die Menge an Papiertüchern, die in diesem Schritt verwendet werden, da zu viel die DNA-Extraktionsspalte verstopfen und folglich die endgültige Menge der gesammelten DNA reduzieren kann. Folgen Sie dem DNA-Extraktionsprotokoll aus einem FFPE-Kit, um die DNA-Extraktion durchzuführen. Mit Hilfe eines Laborspektrophotometers 1 Mikroliter DNA laden und die Absorption bei 216 nm zur Quantifizierung messen.
1 Mikroliter DNA auf ein 2%Agarose-Gel laden und Gelelektrophorese bei einer Spannung von 80 bis 100 Volt laufen lassen, um eine qualitative Bewertung durchzuführen. Wählen Sie auf der Grundlage der DNA-Auswertungsergebnisse das VOLUMEN der DNA aus, das in der Multiplex-Kurz-Tandem-Wiederholungs-PCR-Amplifikation verwendet werden soll. Ziel ist es, mindestens 1000 Nanogramm DNA zu verwenden.
Fahren Sie mit pcR-Verstärkung, Kapillarelektrophorese und Datenanalyse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Um den idealen FFPE-Block auszuwählen, wählen Sie mit H&E-Dias auf einem Lichtmikroskop einen FFPE-Block aus, der etwa 50 bis 70 % seines Gewebes aus Chorionzotten enthält. Für Blöcke, die nicht die ideale Menge an Chorionzotten haben, bereichern Sie für Chorionzotten, wenn der Schnitt durchgeführt wird.
Identifizieren Sie dazu, welche Seite der frisch geschnittenen Abschnitte mehr Chorionzotten gemäß der entsprechenden H&E-Folie enthält. Dann verwenden Sie eine Klinge, um die andere Hälfte abzuschneiden, die verworfen werden muss, um für Chorionzotten zu bereichern. Um den bestmöglichen FFPE-Block zu schneiden, schneiden Sie vier Abschnitte, die 50 Mikrometer dick sind, mit einem Mikrotom.
Für den Fall, dass kein idealer FFPE-Block verfügbar ist, soll das Verhältnis von Chorionzotten zu mütterlichem Gewebe dennoch erhalten bleiben. Wenn z. B. nur 30 % des Blocks aus Chorionzotten bestehen, während der Rest mütterliche Gewebe hat, entfernen Sie mindestens die Hälfte des Abschnitts, der das mütterliche Gewebe enthält, und verwenden Sie mehr Abschnitte, um dies zu kompensieren. Platzieren Sie die Abschnitte in beschrifteten 15 ml-Rohren.
Für die Deparaffinierung und Rehydratation, arbeiten Sie in einer Dunstabzugshaube, um jedes Reagenz hinzuzufügen und warten Sie den entsprechenden Zeitraum, wie im Textprotokoll tabellarisch aufgeführt. Entfernen Sie dann das Reagenz durch Vakuumabsaugung mit einer Pasteur-Pipette. Als nächstes fügen Sie vier Grad Celsius Citrat-Lösung zu den 15 ml-Rohren hinzu.
Nachdem Sie zwei Stunden lang ein 80 Grad Celsius Wasserbad eingelassen haben, lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen. Entfernen Sie die Citratlösung durch Vakuumabsaugung. Fügen Sie sechs Milliliter 1x PBS, Wirbel, und warten Sie ein bis zwei Minuten, damit sich das Gewebe nach unten absetzen kann.
Zentrifugieren Sie die Proben bei Bedarf 30 Sekunden lang bei 1000 U/min. Entfernen Sie die 1X PBS durch Vakuumabsaugung. Nun fügen Sie eine ml vorgewärmte Pepsin-Lösung und legen Sie in einem 37 Grad Celsius trockenen Bad für 30 Minuten.
Wirbel alle 10 Minuten. Bereiten Sie die Propidiumiodidribonuklease A Lösung in den letzten 10 Minuten dieser Inkubation vor. Fügen Sie weitere sechs ml 1x PBS, Wirbel, und warten Sie ein bis zwei Minuten, damit sich das Gewebe nach unten absetzen kann.
Entfernen Sie die 1x PBS wiederum durch Vakuumabsaugung. 550 Mikroliter der Propidiumiodid-Ribonuclease-A-Lösung hinzufügen und die Proben 30 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius trockenes Bad geben. Verwenden Sie Zangen, um ein fünf mal fünf cm großes Stück 48 Mikron Filtrationsgewebe im oberen Teil der Polystyrol-Rundbodenrohre für den Einsatz mit dem Durchflusszytometer zu platzieren.
Filtern Sie die Lösung, indem Sie die Flüssigkeit durch das Netz in das Rohr leiten. Die Proben können nun auf dem Durchflusszytometer ausgeführt werden. Bewahren Sie sie in Folie eingewickelt auf, bis sie zum Laufen bereit sind.
Führen Sie schließlich die Flusszytometrie und die Datenanalyse durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Mikrosatelliten-Genotypisierung eines partiellen hydatidiformen Maulwurfs, zusammen mit der DNA der Patientin und ihres Partners, zeigt, dass der Maulwurf des Patienten triploid dispermisch ist. Der erste 1. Marker zeigt zwei Spitzen im Produkt der Empfängnis.
Der erste Gipfel stammt von der Mutter, da nur die Mutter einen Gipfel dieser Größe hat. Nach der gleichen Argumentation stammt der zweite Gipfel vom Vater, da er dasselbe Allel teilt. Beachten Sie, wie der zweite Peak viel höher als der erste ist, was darauf hindeutet, dass es wahrscheinlich zwei Dosen des gleichen väterlichen Alleels in diesem Peak gibt.
Die mütterliche Kontamination ist in diesem Produkt der Empfängnis sehr gering, da sie einen sehr winzigen Spitzenwert an der Position des zweiten mütterlichen Alleels zeigt. Der zweite Marker zeigt drei Spitzen im Produkt der Empfängnis. Zwei dieser Gipfel stammen vom Vater und einer von der Mutter.
Die dritte und vierte Markierung ähneln dem ersten Marker und zeigen auch zwei Allele, die vom Vater und eine von der Mutter kommen. Da alle vier Marker durchweg drei Allele aufweisen, zwei vom Vater und einer von der Mutter, kann man schlussfolgern, dass dieses Empfängnisprodukt triploid dispermisch ist und die Diagnose eines Partmolels bestätigt. Für die Interpretation der Genotypisierungsergebnisse ist es wichtig, sich des Verschmutzungsgrads bewusst zu sein, der auf den während der Reinigungsschritten gemachten Notizen basiert.
In einigen Fällen sind wir nicht in der Lage, eine Schlussfolgerung nach diesen beiden Methoden zu ziehen. In solchen Fällen verwenden wir andere Methoden wie FISH, um die wahren Genotypen aufzudecken. Die Mikrosatelliten-Genotypisierung hat eine genaue Moldiagnose ermöglicht und den Weg geebnet, um die Genotypen besser zu verstehen, die mit den verschiedenen Merkmalen von hydatidiform-Molen verbunden sind.
