Das 3D-Organoidsystem gilt als physiologisch relevanter als 2D-Assays und kann wertvolle Informationen über die Biologie liefern, die andernfalls eine Herausforderung darstellen würde. Dies ist ein anpassungsfähiges System, bei dem wir pharmakologische und genetische Manipulationen mit weniger Zeit und deutlich geringeren Kosten testen können als mit einem In-vivo-Ansatz. Matrix-Studie ist sehr schwierig zu handhaben, da es sich verfestigt, wenn es Raumtemperatur erreicht.
Sie kann nur dann durch eine Pipette gezogen werden, wenn sie flüssig ist und auf Eis gehalten werden muss. Die Integrität des Rings ist wichtig zu erhalten. Wenn die Struktur gestört ist, kann dies das organoide Wachstum negativ beeinflussen, und Sie können leicht Material verlieren, wenn Sie Medien wechseln.
Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung von Mausbasal- und luminalen Prostataepithelzellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Waschen Sie das Zellpellet in 500 Mikroliter Mausorganoidmedien, und setzen Sie das Pellet dann bei einer Zelldichte von 1 000 Zellen pro Mikroliter wieder auf. Um Master-Mischungen vorzubereiten, mischen Sie Epithelzellen, die in Mausorganoidmedien suspendiert sind, mit Matrixgel, um eine endgültige Mischung zu erzeugen, die 25% Zellen in Medien und 75%Matrix-Gel enthält.
Je nach nachgeschalteter Anwendung werden Basalzellen in der Regel mit einer Konzentration von 100 bis 2.000 Zellen pro 80 Mikroliter plattiert, während Leuchtzellen mit einer Konzentration von 2 000 bis 10 000 Zellen pro 80 Mikroliter plattiert werden. Für jede Zellmischung 80 Mikroliter des Matrixgels pro Bohrung einer 24-Well-Platte hinzufügen. Pipette ein Tröpfchen auf die untere Hälfte der Wand des Brunnens unter Vermeidung des direkten Kontakts mit der Poly-Hema-Beschichtung.
Nach dem Hinzufügen des Matrixgels, wirbeln Sie die Platte, damit die Matrix-Gel-Zell-Mischung einen Ring um den Rand des Brunnens bilden kann. Legen Sie die 24-Well-Platte für 10 Minuten in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator rechts nach oben, damit das Matrixgel teilweise aushärten kann. Nach der Inkubation für 10 Minuten die 24-Well-Platte auf den Kopf stellen und weitere 50 Minuten brüten, damit das Matrixgel vollständig aushärten kann.
Dann fügen Sie 350 Mikroliter vorgewärmtmausorganoide Medien tropfenweise in die Mitte jedes Brunnens. Nach dem Hinzufügen der Medien, geben Sie die 24-Well-Platte an den Inkubator zurück. Um die organoiden Medien der Maus aufzufüllen, neigen Sie die 24-Well-Platte in einem 45-Grad-Winkel, und entfernen Sie die vorhandenen Medien vorsichtig aus der Mitte jedes Brunnens mit einer P1000-Pipette, während Sie den Matrix-Gelring vermeiden.
Fügen Sie 350 Mikroliter vorgewärmter Mausorganoidmedien wie bisher hinzu. Es wird empfohlen, ein größeres Volumen an Medien zu Organoiden, die länger als fünf Tage kultiviert werden, hinzuzufügen, um eine schnelle Erschöpfung der wichtigsten Nährstoffe und Wachstumsfaktoren zu verhindern. Entfernen Sie die Medien aus jedem Brunnen wie zuvor.
Um Organoide zu sammeln, sprengen Sie das Matrixgel wiederholt, indem Sie einen Milliliter vorgewärmter Dispase-haltigemedien Medien direkt auf den Matrix-Gel-Ring pfeifen, bis der gesamte Ring entfernt ist. Übertragen Sie die dislodged Matrix Gel OrganoidMischung in ein 1,5-Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Nach vollständiger Verdauung, wie im Textprotokoll beschrieben, fügen Sie phosphatgepufferte Saline in das Organoidpellet ein und setzen Sie sie durch sanftes Flicken wieder auf.
Pellet die Organoide durch Zentrifugation bei 800 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette. Die organoiden Pellets in 100 Mikroliter Proteinlysepuffer pro 10 Mikroliter gepacktem Zellvolumen wieder aufhängen. Flick, um erneut zu suspendieren.
Beschallen Sie nun die Organoide, indem Sie Röhren in nasses Eis tauchen und die Spitze des Schalldismembrators sanft auf die Außenseite des Mikrozentrifugenrohrs auftragen. Beschallen Sie für 40 Sekunden bei 20 Kilohertz, bevor Sie mit etablierten Protokollen zum Western Blotting übergehen. Um Prostata-Organoide aus den 24-Well-Platten zu sammeln, entfernen Sie die Medien von jedem Brunnen wie zuvor.
Verdauen Sie das Matrixgel, indem Sie es mit 500 Mikrolitern dispasehaltigen Medien 30 Minuten lang in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator mit 5%CO2-Inkubator inkubieren. Sammeln Sie verdaut organoide Suspension in einem Mikrozentrifugenrohr. Dann pellet die Organoide durch Zentrifugation bei 800 mal G für drei Minuten bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand.
Um eine immunfluoreszierende Färbung von Prostataorganoiden mit einer ganzen Montage durchzuführen, fügen Sie zunächst 500 Mikroliter 4%Paraformaldehyd in PBS hinzu. Die Organoide zwei Stunden bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln bebrüten. Nach dem Waschen des Pellets, wie im Textprotokoll beschrieben, fügen Sie ein Mikrogramm pro Milliliter DAPI-Färbung in der Blockierlösung hinzu und inkubieren Sie für zwei Stunden bei Raumtemperatur.
Schützen Sie die Probe während der Inkubation vor Licht, und schützen Sie sie vor diesem Schritt nach vorn. Nach zentrifugieren der Organoide wie zuvor, primärer Antikörper in Blockierlösung hinzufügen und über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln inkubieren. Pellet die Organoide wieder, und waschen Sie das Pellet mit einem Milliter PBS für 15 Minuten mit sanftem Schütteln.
Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal. Dann sekundären Antikörper in Blockierlösung hinzufügen, und über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation die Organoide pellet und das Pellet zusätzlich zwei Mal waschen.
Fügen Sie einen Milliliter 30%Saccharose in PBS mit 1%Triton X-100 zu den pelletierten Organoiden hinzu. Dann für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln inkubieren. Nach dem erneuten Pelletieren der Organoide einen Millimeter 45%Saccharose in PBS mit 1%Triton X-100 hinzufügen und bei Raumtemperatur zwei Stunden lang sanft schütteln.
Wiederholen Sie dann den Vorgang, außer einen Milliliter 60% Saccharose in PBS mit 1%Triton X-100 hinzufügen. Pellet die Organoide durch Zentrifugation bei 800 mal G für drei Minuten bei Raumtemperatur, und entfernen Sie 95% des Überstandes. Beobachten Sie das Pellet unter UV-Licht, um zu bestätigen, dass es während der Entfernung des Überstandes nicht verloren ging.
Das Pellet wird lockerer, wenn die Konzentration von Saccharose höher wird. 10 bis 20 Mikroliter der verbleibenden Suspension auf einen kammerierten Deckelschlupf übertragen und zur konfokalen Mikroskopie überführen. Basale und leuchtdichte Zellen bilden Organoide mit ausgeprägten Morphologien.
Während die meisten basalabgeleiteten Organoide nach sieben Tagen in der Kultur ähnlich groß sind, weisen luminale Organoide signifikante Heterogenität auf. Darüber hinaus enthalten die meisten basalabgeleiteten Organoide Lumen, die von mehrschichtigem Epithel umgeben sind, während luminale-abgeleitete Organoide in der Morphologie von hohl mit einlagigem Epithel bis zu feststehenden mit mehrschichtigen Zellschnüren reichen, die nicht kanalisieren. Die Western-Blot-Analyse ergab, dass Basal- und Luminal-abgeleitete Organoide Merkmale beibehalten, die mit basalen und luminalen Primärzellen assoziiert sind.
Basalabgeleitete Organoide exprimieren höhere Konzentrationen des Basalmarkers Cytokeratin 5, während luminale Organoide höhere Konzentrationen des luminalen Markers Cytokeratin 8 exprimieren. Sowohl Basal- als auch Luminalmarker wurden in Basal- und Luminal-abgeleiteten Organoiden in der Massenpopulation nachgewiesen, was vielleicht auf eine Differenzierung hindeutet. Basalabgeleitete Organoide enthalten mehrschichtiges Epithel, wobei äußere Schichten hohe Konzentrationen des Basalmarkers p63 und innere Schichten mit nicht nachweisbaren Ebenen exdrücken.
Äußere Schichten exprimieren auch moderate Ebenen des luminalen Markers Cytokeratin 8, und innere Schichten haben hohe Ebenen. Während alle Zellen in einschichtigen luminalen Organoiden positiv für Cytokeratin 8 färben, enthielten nur ausgewählte Zellen Kernzellen p63. Beim Umgang mit Matrixgel ist darauf zu achten, dass es nicht aushärtet, bevor Zellen in die Organoidkultur eingeschichten werden.
DAPI, das für die Mikroskopie verwendet wird, kann Hautreizungen verursachen. UV-Licht kann auch schädlich sein. Eine angemessene persönliche Schutzausrüstung ist unerlässlich.
Wir können RNA von Organoiden sammeln, um RNA-Sequenzierung durchzuführen, die uns darüber informiert, wie sich Genexpressionsprofile während der Organoidbildung oder als Reaktion auf Manipulationen verändern. Dieses Modell hat es dem Prostatafeld ermöglicht, einen reproduzierbaren Ex-vivo-Assay zu haben, um grundlegende Aspekte der Epithelbiologie zu untersuchen und Regulatoren in Entwicklung und Differenzierung zu identifizieren.
