Lymphozytentransmigration ist ein wichtiges Merkmal jeder Immunantwort. Daher ist dieses Protokoll von Bedeutung, da es es einem Forscher ermöglicht, die Mobilität von Lymphozyten in einem genau definierten In-vitro-System zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass verschiedene Chemokine bewertet werden können, um ihre Wirksamkeit der Induktion der Migration in kürzlich definierten Zellen zu bestimmen, wie die Gruppe zwei angeborene lymphoide Zellen, oder ILC2.
Ein zweiter Vorteil ist, dass Inhibitoren oder biologische Therapien zur Blockierung bestimmter Chemokinwege mit dieser Methode getestet werden können, bevor teurere Experimente mit Tieren durchgeführt werden. Beginnen Sie mit der Ausscheidung von Lungen und Milz von eingeschläferten eizellenbehandelten männlichen und weiblichen Mäusen mit zwei bis drei Tieren pro Gruppe. Zerlegen Sie ausgeschnittene Gewebe in separate Dissoziationsröhren nach Gewebetyp und tierischem Geschlecht.
Legen Sie das Lungengewebe in 500 Mikroliter Lungendissoziationsmedien in ein Dissoziationsrohr, legen Sie das Rohr in den automatisierten Gewebedissoziator und dissoziieren Sie es mit dem Lungenprotokoll. Wiederholen Sie diese Schritte insgesamt zweimal. Um Milzgewebe zu dissoziieren, legen Sie es in 500 Mikroliter vollständiger RPMI-Medien in den Dissoziator, und verwenden Sie dann das Milzprotokoll.
Wenn Sie in einem biologischen Sicherheitsschrank mit steriler Technik arbeiten, filtern Sie jedes dissoziierte Gewebe durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb und sammeln Sie sich in 50-Milliliter konische Schläuche. Spülen Sie die dissoziationsröhren, die Lungenhomogenate enthalten, mit fünf Millilitern zusätzlicher Lungendissoziationsmedien, Mitmilenhomogenaten mit fünf Millilitern vollständigem RPMI und filtern Sie deren Inhalt durch die Filter, die für die entsprechenden Gewebe verwendet werden. Um das Lungengewebe weiter zu dissoziieren, inkubieren Sie die Lunge 15 bis 30 Minuten in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator mit 5% Kohlendioxid.
Dann fügen Sie fünf Milliliter komplette sRPMI sowohl auf die Lunge und Milz Homogenate, und Zentrifuge. Nach dem Wegwerfen des Überstandes die Pellets mit Splenozyten und Lungenzellen aus der Gruppe der Tiere des gleichen Geschlechts zu einem einzigen 50-Milliliter konischen Röhrchen kombinieren. Fügen Sie 10 Milliliter vollständiger RPMI zu jeder Röhre hinzu, und setzen Sie sie erneut aus.
Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen mithilfe eines automatisierten Zellenzählers. Stellen Sie männliche und weibliche Zellsuspensionen auf 100 Millionen Zellen pro Milliliter im Trennpuffer ein und fügen Sie sie dann zu einem Polystyrolrohr mit fünf Millilitern hinzu. Nach der Isolierung von Gruppe zwei angeborene lymphoide Zellen aus 2/3 der gesamten Zellen, wie im Manuskript beschrieben, verwenden Sie die verbleibenden Zellen für die CD4-positive T-Zell-Isolation.
Um die CD4-positive T-Zellisolierung zu starten, fügen Sie der CD4 T-Zellanreicherungsuspension Rattenserum hinzu. Dann fügen Sie Isolationscocktail in die Zellprobe, und inkubieren für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wirbel schnelle Kugeln für 30 Sekunden, und fügen Sie die Zellprobe, um eine Verdünnung von 75 Mikroliter pro Milliliter zu erreichen.
Sanft mischen und für 2 1/2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Die Proben mit etwa zwei Millilitern Trennpuffer bis zu drei Millilitern topisieren, die Fünf-Milliliter-Rohre in den achtkammerigen Leichttrennmagneten geben und bei Raumtemperatur fünf Minuten brüten. Dann kippen Sie den Magneten nach vorne und pipette jede Zellsuspension in ein sauberes Fünf-Milliliter-Rohr.
Fügen Sie 1,5 Milliliter serumfreies RPMI zu jedem Rohr und Zentrifuge hinzu. Gießen Sie den Überstand ab und setzen Sie das CD4-positive T-Zellpellet bei 10 Millionen Zellen pro Milliliter in serumfreiem RPMI wieder aus. Um diesen Teil des Protokolls zu beginnen, bestimmen Sie die Anzahl der Transwell-Einsätze, die für das Experiment für ILC2- und CD4-positive T-Zellen benötigt werden, wie im Manuskript beschrieben.
Bewegen Sie drei Mikrometer Transwell-Einsätze vorsichtig von den mittleren Reihen einer 24-Well-Platte in die obere und untere Reihe der gleichen 24-Well-Platte mit einer Pipette-Spitze und Handhand. Fügen Sie 500 Mikroliter Migrationsmedien mit CCL17 zu 1/3 der Brunnen in der mittleren Reihe der 24-Well-Platte hinzu. Fügen Sie 500 Mikroliter Migrationsmedien mit CCL22 zu einem weiteren 1/3 der Brunnen hinzu.
Und schließlich fügen Sie 500 Mikroliter serumfreies RPMI, das kein Chemokin enthält, zu den letzten 1/3 der Brunnen hinzu. Beschriften Sie den Deckel auf der Platte deutlich mit dem Namen der entsprechenden Transmigrationsmedien, die in den unteren Brunnen platziert sind. Dann legen Sie die Transwell-Einsätze wieder in die Brunnen mit den verschiedenen Behandlungen.
Fügen Sie vorsichtig 100 Mikroliter CD4 T-Zellen oder ILC2 an den oberen Brunnen jedes Einsatzes, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension in den Transwells nicht gemischt oder pipette. Beschriften Sie den Deckel auf der Platte klar mit dem Zelltyp, der in jedem Brunnen platziert ist, und schreiben Sie das Datum und die Uhrzeit, zu der die Zellen hinzugefügt wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Transwell-Einsätze von der Platte entfernen, bis alle Zellen in Transwell-Einsätzen mit Medien platziert wurden.
Sobald die von Interesse wichtigen Zellen isoliert sind, sind die wichtigsten Schritte, die Chemokine und Zelltypen, die in bestimmten Brunnen platziert werden, zu verfolgen, sanft Zellen zu den oberen Kammern hinzuzufügen und schließlich unnötigen Kontakt mit der Transmigrationsplatte während der 48-stündigen Inkubation zu vermeiden. Legen Sie die Platte vorsichtig in einen 37-Grad-Celsius-Inkubator mit 5% Kohlendioxid und inkubieren Sie 48 Stunden lang, um den Kontakt mit der Platte während der Inkubationszeit zu minimieren. Nachdem Sie die Platte vorsichtig aus dem Inkubator entfernt haben, entfernen Sie alle Transwell-Einsätze aus den mittleren Reihen in die leeren Brunnen direkt darüber oder unten.
Sammeln Sie die Zellen aus den oberen und unteren Brunnen der Transwell-Einsätze in Röhren, die mit CCL17, CCL22 oder Medium beschriftet sind, mit dem Zelltyp und mit der Replikationsnummer. Spülen Sie die unteren Brunnen mit 500 Mikroliter 1x PBS, sammeln Sie sie in die entsprechenden Schläuche und tun Sie das gleiche für die oberen Brunnen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 378-facher g bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Verwenden Sie eine Pipette, um den gesamten Überstand vorsichtig zu entfernen, und setzen Sie dann T-Zelle und ILC2-Pellets mit 50 Mikroliter1x PBS wieder auf. Nach dem Entfernen von 10 Mikroliter der Zellsuspension, fügen Sie 90 Mikroliter von 0,4%Trypan blau. Zählen Sie die Zellen auf dem automatisierten Zellenzähler.
Und für jede Probe, erfassen Prozentsatz der Lebensfähigkeit und Zellzahl pro Milliliter, und bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen pro Behandlung in der oberen und unteren Kammer. Als die CCR4-Expression sowohl an CD4-positiven T-Zellen als auch an ILC2 durch Durchflusszytometrie bewertet wurde, gab es keine Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Wirten. Die Expression von CCR4 auf Zellbasis auf ILC2 war jedoch höher als bei CD4-positiven T-Zellen.
Wenn die untere Kammer des Transwell-Geräts mit unbehandelten Zellkulturmedien, Medien, die CCL22 enthalten, oder Medien, die CCL17 enthalten, gefüllt war, migrierten weniger als 14 % der Zellen unter Medienkontrollbedingungen. Als Reaktion auf CCL22 reagierten beide Zelltypen, unabhängig davon, ob sie von männlichen oder weiblichen Hosts stammten, auf CCL22. Außerdem induzierte CCL22 eine größere Migration als CCL17 bei männlichen ILC2.
Auf der anderen Seite induzierte CCL17 eine signifikante Migration der weiblichen CD4-T-Zellen und ILC2 im Vergleich zu Medien allein. Die CCL17-Behandlung war nicht anders als die Medien für männliche CD4-positive T-Zellen oder männliche ILC2. Unter suboptimalen Bedingungen, wenn die Platte mit CD4-Zellen die ersten 24 Stunden bei Raumtemperatur blieb und dann in den Inkubator verschoben wurde, gab es keine Migration in Richtung CCL22 und CCL17.
Darüber hinaus war die Lebensfähigkeit der Zellen für die Zellen in der unteren Kammer besonders gering, was zeigt, wie wichtig es ist, die in diesem Protokoll beschriebenen richtigen Temperaturen und Bedingungen zu verwenden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Sobald das Transmigrationsverfahren abgeschlossen ist, sollte man eine signifikante Migration in das Chemokin von Interesse im Vergleich zu den Medienkontrollbrunnen sehen. Wenn keine signifikante Migration beobachtet wird, kann man davon ausgehen, dass das Verfahren nicht richtig funktioniert hat oder dass die Lymphozyten nicht auf das betreffende Chemokin reagieren.
Diese Technik kann allgemein verwendet werden, um Lymphozytenmigration zu verstehen, wenn diese Lymphozyten eine breite Palette von In-vivo-Behandlungen durchlaufen haben.
