Diese Technik ermöglicht eine genaue und präzise Quantifizierung von Mikroorganismen aus einer gemischten Population von sehr ähnlichen Stämmen mit schnellen und hochdurchsatzmolekularen Techniken. Letztlich, um Vergleiche der Fitness zwischen Stämmen zu ermöglichen. Die Fähigkeit, viele Stämme gleichzeitig in einem einzigen Pool zu bewerten, reduziert die Variabilität von Wohl-zu-Gut oder Organismus-Organismus erheblich, da alle Stämme genau den gleichen Bedingungen ausgesetzt sind.
Die Anpassungsfähigkeit dieser Technik ermöglicht es, es für fast jeden genetisch formbaren Organismus und fast jedes experimentelle Design, das eine genaue Quantifizierung von Mikroben erfordert, zu verwenden. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Entwicklung genetischer Marker auf bakterielle Chromosomen, wie im Textprotokoll beschrieben. Erstellen Sie einen Pool genomischer DNA, der jeden Barcode mit Ausnahme eines Barcodes enthält.
Verwenden Sie diesen Pool als Verdünnungsmittel, um eine Verdünnungsserie mit genomischer DNA durchzuführen, die den einzelnen verbleibenden Barcode enthält. Bereiten Sie Reaktionen für digitale PCR in doppelter Weise gemäß den Empfehlungen des Herstellers für die Verwendung eines digitalen PCR-Supermix für die sondenbasierte Chemie vor. Verwenden Sie die gepoolte genomische DNA als Vorlagen-DNA.
Fügen Sie auch den Master Mix mit 20 X Primer-Sonde hinzu, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie Replizien-Steuerungsreaktionen für digitale PCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor. Kontrollreaktionen für jeden Prüfpunktmix müssen aus keine Vorlagensteuerelemente, Negativkontrollen und positiven Steuerelementen bestehen.
Wiederholen Sie diese Schritte, um digitale PCR-Reaktionen für jede genomische DNA-Probe mit Barcodes zu erstellen. Generieren Sie Tröpfchen für jede Reaktionsbedingung mit einem Tröpfchengenerator, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Neu angelegte Tröpfchen in die entsprechende 96-Wellplatte geben.
Verwenden Sie 200 Mikroliter Pipettenspitzen auf einer 5 bis 50 Mikroliter Mehrkanalpipette. Nachdem alle Tröpfchen erzeugt und übertragen wurden, versiegeln Sie die Platte mit einem Folienplattenversiegeler. Verwenden Sie den vom Hersteller empfohlenen Thermocycler, um die Zyklusbedingungen auszuführen.
Während Thermocycling durchgeführt wird, programmieren Sie die Datenanalysesoftware mit den verwendeten Platteneinstellungen, wie Beispielname, Experimentiertyp und Supermix. Enthalten auch Target 1 Name und Target 1 Typ, sowie Ziel 2 Name und Ziel 2 Typ. Nachdem das Thermocycling abgeschlossen ist, übertragen Sie die abgeschlossenen Reaktionen auf den Tröpfchenleser und starten Sie den Lesevorgang gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Wenn alle Brunnen gelesen wurden und die Ausführung abgeschlossen ist, öffnen Sie die QLP-Datendatei mit der Datenanalysesoftware. Wählen Sie alle Brunnen, die die gleiche Primersonde Mastermix verwenden. Untersuchen Sie auf der Registerkarte Tröpfchen die Anzahl der in jedem Brunnen analysierten Tröpfchen, einschließlich positiver und negativer Tröpfchen.
Schließen Sie alle Brunnen aus, der weniger als 10.000 Tröpfchen insgesamt beträgt. Wechseln Sie zur Registerkarte 1D-Amplituden, und untersuchen Sie die Amplituden positiver und negativer Tröpfchen. Stellen Sie sicher, dass sie aus 2 verschiedenen Populationen bestehen.
Verwenden Sie innerhalb der Software die Schwellenwertfunktion, um einen Cutoff zwischen positiven und negativen Tröpfchen für jede sonde zu machen, die verwendet wurde. Sobald entsprechende Schwellenwerte auf alle Brunnen angewendet wurden, berechnet die Software die Anzahl der DNA-Kopien in jeder Reaktion. Exportieren Sie Daten in eine Kalkulationstabelle, um weitere Analysen zu erleichtern.
Berechnen Sie anhand dieser Werte die anfängliche Kopiernummer jedes eindeutigen genomischen Barcodes in der Stichprobe. Bestimmen Sie die mittlere falsch positive Rate von den negativen Kontrollreaktionen und subtrahieren Sie diesen Wert von den Werten, die in experimentellen Reaktionen erhalten wurden. Multiplizieren Sie die Werte nach Bedarf, basierend auf den Verdünnungen, die beim Einrichten der einzelnen Experimente durchgeführt wurden.
Bestimmen Sie nun die relative Eignung eines Organismus, indem Sie den Wettbewerbsindex berechnen oder den Wettbewerbsindex aus der digitalen PCR-basierten Quantifizierung des Barcode-Stamms streichen. Führen Sie diesen Schritt für jeden Barcode-Stamm zu allen Zeitpunkten aus. Genomische DNA, die den AA-Barcode enthielt, wurde im Hintergrund aller anderen barcoded genomischen DNA verdünnt.
Kanal 1 stellt die FAM-Sonde für den AA-Barcode dar, während Kanal 2 die HEX-Sonde für den AO-Barcode darstellt. Die Ergebnisse jeder Sonde werden sowohl als einzelne Tröpfchenfluoreszenzamplitude als auch als Histogramm dargestellt, das die Häufigkeit der fluoreszierenden Intensität aller Tröpfchen in den ausgewählten Brunnen darstellt. Für jede Bedingung sollten positive und negative Tröpfchen 2 unterschiedliche Populationen bilden.
Die Populationen sollten mithilfe des Schwellenwert-Features getrennt werden, um positive und negative Tröpfchen zu definieren. Die Schwellenwerte variieren je nach den verwendeten Prüfpunkten, aber alle Bohrungen, die dieselbe Sondenmischung verwenden, sollten identische Schwellenwerte aufweisen. Im Fall von AA, das verdünnt wurde, scheint das Histogramm nur die einzelne Population darzustellen, da positive Tröpfchen durch negative Tröpfchen erheblich übersteigen.
Allerdings sind zwei verschiedene Populationen immer noch sichtbar, indem sie die Fluoreszenzamplitude von Tröpfchen in den linken Panels untersuchen. Als die AA-Barcode-Genom-DNA verdünnt wurde, gab es einen Rückgang der positiven Tröpfchen, während die Anzahl der positiven AO-Tröpfchen konstant bleibt. Sobald entsprechende Schwellenwerte auf alle Brunnen angewendet wurden, berechnet die Software die Anzahl der DNA-Kopien in jeder Reaktion.
Wenn Sie routinemäßig PCR als Teil Ihrer Forschung durchführen, können Sie diese Technik durchführen, um die Fitness Ihres Modellorganismus zu beurteilen. Dieses Verfahren würde normalerweise verwendet werden, um die Endergebnisse von vorgelagerten Experimenten zu bestimmen. Sein wahrer Nutzen ist es, Leichtigkeit und Vielseitigkeit für alle Experimente zu fördern, die auf bakterielle Quantifizierung angewiesen sind.
Wir verwenden diese Technik, um Salmonellen-Fitness in einem murinen Modell der Infektion zu bewerten. Darüber hinaus wird diese Technik für den Einsatz mit anderen pathogenen Mikroorganismen in unserem Labor angepasst.
