Dieses Protokoll ermöglicht es Forschern, das Überleben auf einzelzelliger Basis zu überwachen und Variablen zu identifizieren, die den Zelltod oder das Überleben signifikant vorhersagen. Herkömmliche Zytotoxizitätstests bewerten Populationen von Zellen und sind nicht in der Lage, einzelne Zellen zu diskriminieren. Die Längsmikroskopie ermöglicht die Zuordnung des Todeszeitpunkts für jede Zelle in einer Population.
Diese Technik eignet sich gut für die Bewertung neuer Therapien für neurodegenerative Erkrankungen und andere Erkrankungen. Diese Methode hat sich als von unschätzbarem Wert für die Erforschung von Krankheitsmechanismen bei neurodegenerativen Erkrankungen erwiesen und könnte mit gleicher Wirksamkeit auf andere Erkrankungen angewendet werden, bei denen der Zelltod von Interesse ist. Forscher können mit der Erreichung angemessener Transfezeffizienzohne übermäßige Toxizität kämpfen.
Das Üben mit der Mehrkanalpipetten und die Vertrautheit mit dem Protokoll sollte diese Schwierigkeiten im Laufe der Zeit verringern. Mikroskopie ist eine von Natur aus visuelle Methode. Daher kann die Technik leichter verstanden werden, indem man zusätzlich zum Lesen zuschaut.
Kombinieren Sie zunächst die entsprechende Menge an reduzierten Serummedien und Transfektionsreagenz in einem Rohr und reduzierte Serummedien und DNA in einem separaten Rohr. Inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für fünf Minuten. Dann kombinieren Sie den Inhalt beider Rohre und inkubieren bei Raumtemperatur für 20 Minuten.
Verwenden Sie eine Mehrkanalpipetten und sterile Kunststofftröge, um die kortikalen Neuronen zweimal mit 100 Mikrolitern neuronalen Basalmedien pro Brunnen zu waschen. Und die konditionierten Medien und andere verbleibende Medien bei 37 Grad Celsius aufbewahren. Ersetzen Sie die NBM durch 100 Mikroliter zuvor vorbereitete NBKY-Lösung pro Brunnen.
Nach 20 Minuten fallen 50 Mikroliter des Transfektionsreagenzes und der DNA-Mischung in jeden Brunnen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Spülen Sie die Zellen zweimal mit NBKY-Lösung.
Dann fügen Sie 100 Mikroliter konditionierte Medien und 100 Mikroliter NBC-Lösung in die Brunnen. Um mit der Bildgebung der Zellen zu beginnen, legen Sie die 96-Well-Platte auf ein Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie eine für jede Platte eindeutige Treuhandmarke als Referenz für die zukünftige Ausrichtung, und speichern Sie ein Bild für zukünftige Referenzen.
Navigieren Sie dann zu Interessenbereichen und zeichnen ihre x- und y-Koordinaten relativ zur Markierung auf. Verwenden Sie eine für jede Platte eindeutige Treuhandmarke als Referenz für die zukünftige Ausrichtung, und speichern Sie ein Bild für zukünftige Referenzen. Konzentrieren Sie sich schließlich auf die transfizierten Zellen, die ein fluoreszierendes Etikett ausdrücken.
Nehmen Sie mehrere Bilder in regelmäßigen Abständen in den entsprechenden fluoreszierenden Kanälen auf. Um mit der Bildverarbeitung zu beginnen, doppelklicken Sie auf das Fidschi-Symbol. Klicken Sie dann auf das Bild unterund auf das Fidschi-Makro, um das Makro in Fidschi zu öffnen.
Passen Sie die Zeilen zwei bis sieben des Bildunterstrichs des Verarbeitungsmakros entsprechend dem Textprotokoll an. Klicken Sie dann auf die Nähte und dann auf raster-/sammlungsnähte. Passen Sie die Einstellungen in den Dropdownmenüs, den Typ und die Reihenfolge an, bis ein genau genähtes Bild erstellt wird.
Passen Sie Rastertyp- und Stichreihenfolgevariablen in den Zeilen acht und neun entsprechend dieser Auswahl an. Passen Sie dann Zeile 10 an, um die Anzahl der Bilder pro Bohrung anzugeben, und legen Sie die Option für die Hintergrundsubtraktion in Zeile 14 bei Bedarf auf true fest. Passen Sie Zeile 15 an, um den Rollenkugelradius entsprechend dem Textprotokoll festzulegen, und klicken Sie auf Ausführen.
Öffnen Sie schließlich die Ausgabebildstapel und identifizieren Sie die toten Neuronen manuell gemäß dem Textprotokoll. Zeichnen Sie die Daten in einer Tabellenkalkulationsdatei auf. Um eine statistische Analyse durchzuführen, doppelklicken Sie auf das Symbol für das Überleben.
R-Skript. Markieren Sie Zeile zwei, und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Überlebensbibliothek zu laden. Ändern Sie dann den Pfad in Zeile 5, um die Eingabetabelle aufzurufen, und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen.
Markieren Sie die Zeilen acht und neun, und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Analyse der proportionalen Gefahren von Cox durchzuführen. Markieren Sie die Linien 12 bis 16 und 19 bis 24. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um das kumulative Sterberisiko und die Überlebensdaten als Kaplan-Meier-Kurve darzustellen.
In dieser Studie wurden kortikale Neuronen von Ratten vier Tage nach der Beschichtung mit einem Plasmid transfiziert, das für das fluoreszierende Protein M-Apfel kodiert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden Neuronen alle 24 Stunden an 10 aufeinanderfolgenden Tagen durch Fluoreszenzmikroskopie abgebildet. Nach der Bildaufnahme wurden Die Bilder verarbeitet und sequenziell untersucht, um den Zelltod zu markieren.
Die Todeszeit für jede Zelle wurde durch Veränderungen der Fluoreszenz, Morphologie und Fragmentierung des Zellkörpers bestimmt. Die Analyse der Cox-Proportionalgefahren an den Überlebensdaten der mutierten Neuronen ergab ein Hazard Ratio von 2,2. Dieses Ergebnis deutete auf eine schnellere Sterblichkeitsrate in den mutierten Neuronen im Vergleich zur Wildtyppopulation hin.
Das Wichtigste, was Sie beim Versuch dieses Verfahrens beachten sollten, ist, sorgfältig zu pfeifen. Die Minimierung der Luftexposition und die Vermeidung von Blasen ist entscheidend für eine erfolgreiche Transfektion. Nach der Transfektion kann die Längsfluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um verschiedene Faktoren zu verfolgen, die zum Zelltod beitragen können, einschließlich Proteinlokalisierung, Umsatz und Expressionsniveau, zusätzlich zum Zellüberleben.
Im Bereich der Neurodegeneration hat die Dynamik der Längsmikroskopie Aufschluss darüber geben, ob die Aggregation von krankheitsassoziierten Proteinen ein toxisches oder schützendes Ereignis darstellt. Keines dieser Reagenzien oder Instrumente ist gefährlich.
