Die radioaktive Pulsjagd mit 35 S-markiertem Methionin und Cystein ist nach wie vor die einzige biochemische Methode, um die Proteinbiosynthese mit der Zeit in lebenden Zellen zu untersuchen. Die Proteinbiosynthese umfasst sowohl Die Übersetzung, Faltung und Montage als auch den Handel und Abbau. Die Kombination der radioaktiven Pulsjagd mit der Analyse von Co- und Post-Translation-Proteinmodifikationen, wie Disulfidbindungsbildung und Acetylierung, liefert einen empfindlichen und quantitativen Assay, um den Glauben des Proteins mit der Zeit zu untersuchen.
Für dieses Verfahren ist eine gute Fokussierung und experimentelle Handhabung erforderlich. Eine gute Vorbereitung ist entscheidend, wie Puffer, Ihr radioaktiver Arbeitsbereich und ein klarer Zeitplan. Dieses Video bietet eine klare Schulteransicht des radioaktiven Pulsjagdprotokolls.
Demonstriert wird das Verfahren von Hui Ying Yeoh, einem pHd-Kandidaten aus unserem Labor. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, werden Seed-Transfekten- und Kulturzellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Vor der Pulsjagd, inspizieren Sie Ihre Zellen durch das Mikroskop.
Als nächstes waschen Sie das Geschirr mit zwei Milliliter Waschpuffer. Und zwei Milliliter Hungermedium zu den Zellen und legen Sie die Gerichte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 15 Minuten. Stellen Sie sicher, dass Ihre Pulsjagd in Ordnung ist.
Übertragen Sie das Geschirr auf die Regale im Wasserbad, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius. Stellen Sie sicher, dass die Gerichte in Kontakt mit Wasser sind, aber nicht schwimmen. Starten Sie dann einen Timer.
Mit 40 Sekunden das Hungermedium ansaugen. Mit einer Mikropipette 600 Mikroliter Pulslösung aufstellen. In genau einer Minute, fügen Sie vorsichtig die Pulslösung in die Mitte der Schale.
Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie das Hungermedium entfernen und die Pulslösung für die restlichen Gerichte in einem Minutentakt hinzufügen. Bei genau 11 Minuten und für alle folgenden Gerichte, nach dem Pulsverfolgungsschema, mit Ausnahme der Null-Minuten-Jagdprobe, fügen Sie zwei Milliliter Jagdmedium direkt auf das Gericht. Das Jagdmedium ansaugen und durch zwei Milliliter frisches Jagdmedium ersetzen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle verbleibenden Gerichte im Minutentakt. Wenn der Timer genau 16 Minuten liest, fügen Sie zwei Militer des Verfolgermediums direkt auf die Null-Minuten-Jagdschale, auf dem Pulsmedium, um die Beschriftung zu stoppen. SofortigeSingieren Sie das Medium.
Übertragen Sie die Schale auf eine gekühlte Aluminiumplatte und fügen Sie zwei Militer eiskalten Stop-Puffer. Alle anderen Gerichte bei 37 Grad Celsius in einen Brutkasten geben. Übertragen Sie jede Verfolgungsjagd vom Brutkasten zurück ins Wasserbad zwei Minuten vor dem Ende jeder Jagdzeit.
Zur genauen Jagdzeit für jedes Gericht, aspirieren Sie das Jagdmedium und übertragen Sie die Schale auf eine gekühlte Aluminiumplatte. Fügen Sie zwei Milliliter eiskalten Stop-Puffer hinzu. Lassen Sie alle Gerichte auf Eis und stoppen Puffer, bis es Zeit ist, die Zellen zu lysieren.
Dann die Stop-Lösung ansaugen und alle Teller waschen. Drei gleichzeitig mit zwei Millilitere eiskalte Stop-Lösung. Die Stop-Lösung vollständig ansaugen und 600 Mikroliter Lysepuffer zu zwei Gerichten gleichzeitig hinzufügen.
Mit einem Zellschaber, kratzen Sie die Oberfläche der Schale gründlich, aber sanft, um das Lysat zu mischen. Lysat von jedem Gericht auf ein frisches 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen. Zentrifuge bei 15 000 bis 20 000 G bei vier Grad Celsius für 10 Minuten, um die Kerne zu pellet.
Für die Pulsjagd auf Suspensionszellen sammeln sich fünf Millionen Zellen pro Zeitpunkt in einem 50-Milliliter-Rohr. Führen Sie das Verhungerungsverfahren wie im Text beschrieben aus. Nach dem Hungervorgang im Wasserbad für 15 Minuten, starten Sie den Timer.
In genau einer Minute 275 Mikrocuries unverdünnter Etiketten direkt in das Rohr geben, das Zellen enthält, und wirbeln, um es zu mischen. Fügen Sie bei genau 11 Minuten vier Milliliter Verfolgungsmedien hinzu, um die Beschriftung zu stoppen. Und sofort einen Milliliter auf eine 15 Milliliter Tube auf Eis übertragen, die neun Milliliter eiskalte Stop-Lösung enthält, um die Etikettierung zu stoppen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang der Übertragung eines Milliliters Verfolgungsjagd auf eine Röhre auf Eis, die neun Milliliter Stop-Lösung für jeden aufeinanderfolgenden Verfolgungszeitpunkt enthält. Nach der Immunpräzipitation die letzte Wäsche vollständig ansaugen. Die Perlen in 20 MikroliterTE Puffer und Wirbel wieder aussetzen.
Fügen Sie 20 Mikroliter zweiX-Probenpuffer ohne den Reduktionsmittel hinzu. Wirbeln Sie die Proben und erhitzen Sie sie dann bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Wirbeln Sie die Proben wieder.
Zentrifuge bei 12.000 mal G bei Raumtemperatur für eine Minute. Übertragen Sie 19 Mikroliter des nicht reduzierten Überstandes in ein frisches Mikrozentrifugenrohr, das einen Mikroliter 500 Millimolar DDT enthält. Zentrifugieren Sie bei Bedarf schnell die Probe, so dass sich alle Flüssigkeiten am Boden befinden.
Und bei 95 Grad Celsius fünf Minuten erhitzen. Lassen Sie die reduzierte Probe abkühlen und dann wirbeln. Zentrifugieren Sie sowohl die reduzierten als auch die nicht reduzierten Proben bei 12.000-fachem G bei Raumtemperatur für eine Minute, und fügen Sie dann 1,1 Mikroliter eines Molaren-NEM zu allen Proben hinzu.
In dieser Studie wird ein radioaktiver Pulsjagdansatz verwendet, um die Proteinfaltung und den Transport in intakten Zellen zu analysieren. Die Faltung und Sekretion von HIV ein GP120 aus einer haftenden Pulsjagd wird hier gezeigt. Das nicht reduzierende Gel zeigt die oxidative Faltung von GP120.
Unmittelbar nach der Pulsbeschriftung erscheint es als diffuses Band höher im Gel. Während die Verfolgungsjagd voranschreitet, wandert das Band durch noch diffusere Faltzwischenprodukte nach unten, bis es sich im engen Band ansammelt, das bei GP120 nativ gefaltet ist. Dies tritt auf, da die Bildung von Disulfidbindungen die Kompaktheit des Proteins erhöht, wodurch es schneller wandert als das vollständig reduzierte Protein.
Auf dem reduzierenden Gel wurden die Disulfidbindungen und alle Moleküle reduziert und haben keinen Einfluss auf die Mobiilty. Daher sind Unterschiede in der Mobilität nur das Ergebnis von Veränderungen der Molekularmasse. Die Verschiebung im Laufe der Zeit von der reduzierten Signalpeptid uncleaved Form zu dem reduzierten Signal Peptid spaltenForm stellt die post-translationale Signal Peptid Spaltung von GP120.
Die Beweglichkeit erhöht sich durch den Verlust des Signalpeptids, das während der Verfolgungsjagd zunimmt, da mehr Proteine die native Falte erreichen und ihr Signalpeptid verlieren. Sowohl beim nicht reduzierenden als auch beim reduzierenden Gel beginnt das Signal aufgrund der Sekretion von GP120 ab etwa einer Stunde zu sinken. Dies kann durch die Analyse der Medien überwacht werden.
Diese Methode ist auf jede Zelllinie anwendbar, einschließlich organoider Zellmodelle. Aber der Erfolg hängt stark von der Expressionsebene des Proteins von Interesse ab. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, markieren Sie Ihre Gerichte und halten Sie diese Reihenfolge während des gesamten Experiments.
Stellen Sie sicher, dass alles vorbereitet ist, bevor Sie ein Hungermedium hinzufügen. Dies ist der Beginn des Experiments. Und Deine Laborzeit ist dein Freund, aber du kannst dein größter Feind sein, wenn du nicht vorbereitet bist.
Bills Verfolgungsjagd kann mit einer begrenzten Proteolyse kombiniert werden, um den vollständigen Nachlass von Proteinen mit der Zeit zu untersuchen. Auch verschiedene gewählte Gefriertruhen-Methoden ermöglichen die Analyse von Spül- oder Rigormorisierungs- oder Ladungsunterschieden. Um den Forscher und das Gerät zu schützen, müssen alle lokalen Strahlenschutzvorschriften eingehalten werden.
Und es sollten Schutzmaßnahmen nach Protokoll getroffen werden. Beachten Sie, dass Ihr Acrylamid, das für Ihre STH-Seite verwendet wird, neurotoxisch ist.
