Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Virus-Host-Interaktionsfeld zu beantworten, wie man effektiv eine Virusinfektion bei Drosophila melanogaster etablieren kann. Diese Nanoinjektionsmethode ermöglicht eine präzise Kontrolle der Infektionsdosis des Virus und kann leicht auf Infektionen mit anderen mikrobiellen Krankheitserregern angewendet werden. Beginnen Sie damit, ein mal 10 bis siebentlebensfähige S2-Sternzellen pro Milliliter als lose, halbhafte Monoschicht in einer 10-Zentimeter-Zellkulturschale mit 10 Millilitern komplettem Schneider-Drosophila-Medium ohne zusätzliches Kohlendioxid bei 25 Grad Celsius für eine Stunde zu wachsen.
Während der Inkubation, resuspend frisch aufgetaut Drosophila C Virus oder DCV zu einer Vielzahl von Infektionen von 0,01 in einem Milliliter des gesamten Mediums und fügen Sie Viruslösung zu den Zellkultur-Gerichte. Dann kehren Sie die Platte für drei bis fünf Tage zum 25 Grad Celsius Brutkasten zurück. Das Virus ist bereit für die Sammlung, wenn die Zellmorphologie verschwommen aussieht und das Kulturmedium voll von schwarzen Partikeln ist, die auf Zellablagerungen hinweisen.
Mischen Sie den Überstand, indem Sie ein paar Mal Pipettieren, bevor Sie die gesamte Zellkultur auf eine 15 Milliliter-Röhre für Lyse der Wirtszellen bei minus 80 Grad Celsius übertragen. Um Arbeitskonzentrationen von Virus zu erzeugen, tauen Sie die Zellsuspension in einem 25 Grad Celsius Wasserbad mit ständigem Schütteln auf, bevor Sie die Zellreste durch Zentrifugation granulieren. Dann übertragen Sie den Überstand in eine neue sterile 15-Milliliter-Röhre zum Wirbeln und aliquotieren bis zu 200 Mikroliter Viruslösung pro Tube.
Um die durchschnittliche Virusgewebekultur-Infektionsdosis zu bestimmen, zuerst 10 mal 10 bis die fünf S2-Sternzellen in 100 Mikroliter n. Medium in acht Brunnen pro Spalte in 12 Reihen einer 96-Well-Platte auszusäen. Dann kehren Sie die Platte auf den 25 Grad Celsius Brutkasten zurück. Wählen Sie zufällig fünf Röhren Virus aus minus 80 Grad Celsius Lagerung.
Während sich die Zellen absetzen, füllen Sie 10 sterile 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit 450 Mikroliter sterilem Gesamtmedium und fügen Sie 50 Mikroliter Virusbestand in die erste 1,5 Milliliter-Röhre mit 450 Mikroliter sterilen kompletten Medium verdünnen die Suspensionen 10-fach pro Schritt zum 12. Brunnen. Am Ende der Inkubation 50 Mikroliter jeder Verdünnung in jede Spalte für diese Virusröhre in den entsprechenden Brunnen geben und 50 Mikroliter Kulturmedium ohne Virus zu einem Brunnen pro Spalte als Negativkontrollgut hinzufügen. Legen Sie die Platte dann drei Tage lang im 25 Grad Celsius Inkubator und bewerten Sie die zytopathische Wirkung jedes Virusbestands unter einem Brightfield-Mikroskop bei einer 20-fachen Vergrößerung täglich.
Klassifizieren Sie einen Brunnen, in dem die Zellen verschwommen aussehen und das Medium voll von Fragmenten als positiver Brunnen und ein Brunnen, in dem die Zellmorphologie als negativer Brunnen normal ist. Vor der Zucht 400 Mikroliter 50 Mikroliter pro Milliliter Tetracyclin mit vier Gramm frischem Maismehl-Fliegenfutter gründlich vermischen und das Essen über Nacht auf vier Grad Celsius legen, um das Ethanol zu verdampfen. Am nächsten Morgen, wärmen Sie das Essen auf Raumtemperatur und legen Sie das Essen und 20 weibliche und 10 männliche neu geschlossene Erwachsene fliegt in eine Zuchtfläschchen für eine drei- bis viertägige Brutzeit bei 25 Grad Celsius und 60% Luftfeuchtigkeit unter einem normalen Hell-Dunkel-Zyklus.
Wenn genügend Eier gelegt wurden, sammeln Sie die neu geschlossenen erwachsenen Fliegen unter einem leichten Fluss von Kohlendioxid und züchten Sie die Drosophila noch zwei Mal, wie gerade gezeigt. Nach drei Generationen von Tetracyclin-Behandlung, sammeln fünf Fliegen unter einem leichten Fluss von Kohlendioxid und homogenisieren die Fliegen mit 250 Mikroliter doppeldestilliertem Wasser und ein paar 0,5 Millimeter sterile Keramikperlen. Nach einer Minute 250 Mikroliter 2X Puffer A zur Probe geben, bevor die Proben bei minus 80 Grad Celsius eingefroren werden.
Als nächstes tauen Sie proben von minus 80 Grad Celsius in einem 25 Grad Celsius Wasserbad schnell auf, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation in einem 70 Grad Celsius Wasserbad, bevor die genomische DNA extrahiert und die DNA durch Polymerase-Kettenreaktion nach Standardprotokollen verstärkt wird. Bestätigen Sie das Fehlen von Wolbachia 16 kleiner RNA und wsp in jeder Fliege homogenat durch Gelelektrophorese nach Standardprotokollen. Dann den Wolbachia-freien Fliegenvorrat auf Standard-Maismehl-Fly-Food aufziehen, wie gezeigt.
Für eine Virusinfektion verwenden Sie zunächst ein Stereomikroskop und dünne Zangen, um die Spitze einer Glaskapillarnadel auf den entsprechenden Durchmesser für die Nanoinjektion zu brechen. Um den Injektor zu montieren, legen Sie den Decken-O-Ring und einen weißen Abstandskolben auf den Metallkolben des Injektors mit dem großen Dimple nach außen. Verwenden Sie eine Spritze, die mit einer 30-Spur-Nadel ausgestattet ist, um die Glasnadel mit Mineralöl zu füllen und die Nadel durch den Kragen zu legen.
Legen Sie den größeren O-Ring um die Basis des Kragens etwa einen Millimeter vom stumpfen Ende der Nadel und befestigen Sie die Nadel auf den Kolben des Injektors. Befestigen Sie die Nadel auf dem Kolben und drücken Sie die leere Taste, um den Kolben des Mikroinjektors zu verlängern, bis ein akustisches Signal zu hören ist. Drücken Sie nun die Füllung, um den Kolben fünf Millimeter zurückzuziehen und die Nadel in eine virale Suspension der 100 Plaque bildenden Einheit zu tauchen.
Schütteln Sie eine oder mindestens drei Fläschchen von 20 Wolbachia-freien männlichen Drosophila vorsichtig auf die Injektionsschale. Männliche gestiftete Fliegen werden während der Paarung bevorzugt und die Fortpflanzung kann Weibchen beeinflussen. Dann injizieren Sie den Thorax jeder Fliege mit 50,6 Nanoliter Viruslösung in den etwas helleren farbigen Bereich zwischen der Mesopleura und der Pteropleura und messen Sie die DCV-Last durch zytopathischen Effekt-Assay und quantitative RT PCR von Bodenfliegen, wie gerade gezeigt.
Nach der Injektion die Fliegen vorsichtig in eine frische Durchstechflasche übertragen und die Durchstechflasche in eine horizontale Position bringen, um zu verhindern, dass die Fliegen während der Erholung von der Anästhesie am Medium kleben. Die Injektion ist zeitaufwändig, aber die DCV-Replikation ist sehr schnell, daher ist es sehr wichtig, die genaue Zeit auf dem Rohr aufzuschreiben, sobald alle Fliegen von jeder Durchstechflasche injiziert wurden. Virusinfektionen können Zelllyse induzieren und zytopathische Effekte werden an drei Tagen nach der Infektion beobachtet.
Wolbachia 16s rRNA und wsp Primer können verwendet werden, um das Vorhandensein von Wolbachia und Drosophila zu erkennen, wie gezeigt. Wolbachia-freie Fliegen weisen eine signifikant verminderte Überlebensrate nach einer DCV-Infektion und auf dosisabhängige Weise auf. DCV aktiviert antivirale Signalwege im Wirt, die für eine antivirale Infektion in Drosophila entscheidend sind, wie die verringerte Überlebensrate und erhöhte Viruslast bei Dicer-2-Mutantenfliegen belegen.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass eine Kontamination mit dem Wolbachia-Genotyp die Anfälligkeit der Drosophila-Melanogaster-Fliegen zur DCV-Infektion beeinflussen kann. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie ein größerer genetischer Bildschirm durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über unter definierte Wirtsgene zu beantworten, die für eine Virusinfektion oder antivirale Reaktionen erforderlich sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der menschlichen Viruserkrankung, um die Mechanismen zu erforschen, die Ausbrüchen endemischer menschlicher Virusinfektionen im Drosophila-Melanogaster-Modell zugrunde liegen.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Viren extrem gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der entsprechenden Schutzausrüstung immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
