Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wie die Aktivität eines Gens positiv zu moderieren, indem mRNAs genutzt werden, die in den Zellen und Geweben vorhanden sind. Wie man Leistungsmängel kompensiert und wie man hohe Übersetzungen aus mRNAs in vitro und in vivo erreicht. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Zielgene von SINEUP in lebenden Zellen global untersuchen können, indem wir sie ohne Fixierung und Sammlung bildgeben.
Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich also auf unsere Therapie von haploiden Fällen, da SINEUPs eine zweifache Zunahme eines mangelhaften Proteins, wie Frataxin bei Friedrichs Ataxie, induzieren können. Öffnen Sie zunächst den Zenbu-Browser und klicken Sie auf die interessierte Fantom-Projektdatenbank. Durchsuchen Sie das Zielgen, und überprüfen Sie, ob die Transkriptionsstartsite (TSS) und die Expressionsebene in den gewünschten Zellen und Geweben vorhanden ist.
Um TSS zu bestimmen, konsultieren Sie die Beispielanalyse von Parkinson-Protein sieben, oder PARK7 mRNA. Überprüfen Sie TSS nach Käfig-Spitzenbereich. Um zell- und gewebespezifische Transkriptionsexpressionsniveaus zu bestimmen, wählen Sie den Käfigspitzenbereich aus und klicken Sie auf Vergrößern genomischer Region zur Auswahl.
Überprüfen Sie den PARK7-Ausdruck in der Zelle und den Gewebetyp des Interesses, indem Sie die Liste der Transkriptexpressions am unteren Rand der Seite untersuchen. Dann entwerfen Sie Bindungsdomänensequenzen verschiedener Längen, die 40 Basen vorgelagert entsprechen, und 32 Basen nach dem ersten Methionin oder AUG. Vor der Transfektion mit SINEUPs sind Saatzellen von Interesse auf zwei Poly-d-Lysin beschichteten 24 Brunnenplatten, wie im Manuskript beschrieben.
Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent CO2-Inkubator, um 70 Prozent Konfluenz zu erreichen. Es ist sehr wichtig, Zellen gleichmäßig in den Brunnen zu verteilen, zu diesem Zweck die Platte nach dem Aussaat der Zellen in einer sauberen Bank achtmal sanft hin und her zu schütteln und im fünfProzent IGEN CO2-Inkubator zu wiederholen. Nach der Inkubation das Medium auf 0,4 ml des frischen Mediums ändern.
Zur Analyse von SINEUP-GFP stellen Sie mehrere 1,5 ml Rohre mit 0,1 ml Mischlösung her, mit pEGFP-C2, SINEUP-GFP, Transfektionsreagenzien und OptiMEM in jedem Rohr, und inkubieren Sie das Rohr dann 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Fügen Sie 0,1 ml dieser gemischten Lösung aus jedem Rohr in einen separaten Brunnen einer 24-Well-Platte und beschriften Sie diese Brunnen mit SINEUP-GFP eins, zwei, drei, vier und fünf. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in einem fünf Prozent CO2-Inkubator für 24 Stunden.
Nach 24 Stunden die Zellen mit 0,5 ml PBS waschen. Fügen Sie 25uL von 0,05 Prozent Gewicht pro Volumen Trypsin hinzu und inkubieren Sie in einem fünf Prozent CO2-Inkubator für fünf Minuten. Fügen Sie 275uL Zellmedium pro Brunnen hinzu.
Für die Proteinextraktion nehmen Sie eine der beiden Platten und ernten 225uL oder drei Viertel der Zellen aus einem Brunnen und 75uL oder ein Viertel der Zellen für die RNA-Extraktion, jeweils in eine separate 1,5 ml-Röhre. Zentrifuge bei 6000xg für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation den Überstand vorsichtig aus dem durch Proteinisolierung gekennzeichneten Röhrchen entfernen.
Fügen Sie 60uL Lyse-Lösung zu den Zellen und mischen durch Pipettieren Mix gründlich durch Drehen mit langsamer Geschwindigkeit für eine Stunde bei vier Grad Celsius. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 14.000xg für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um Proteinüberstand zu sammeln. Um die Proteinkonzentration zu bestimmen, bereiten Sie zunächst fünf- bis sechsfache Verdünnung des frischen Rinderserumalbumin-Proteinstandards in reinem reinem Wasser mit Konzentrationen von 0,2 bis 1,5 mg/ml Protein vor.
Zur Herstellung des Arbeitsreageims A Dash-Mischung 20uL Reagenz S zu einem ml Reagenz A in einem zwei ml-Rohr hinzufügen. Fügen Sie fünf uL Wasser als Negativkontrolle hinzu. Und dann, BSA-Standard oder Protein-Probe in jedem Brunnen.
Fügen Sie 25uL Reagenz A Dash, und dann sorgfältig 200uL Reagenz B pro Brunnen hinzufügen, um jede Blasenbildung zu vermeiden. Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, um bei Raumtemperatur fünf bis acht Minuten zu brüten. Messen Sie die Proteinabsorption bei 750nm mit einem Spektralphotometer.
Bereiten Sie eine Standardkurve vor, indem Sie die BSA-Standardproteinkonzentrationen auf der x-Achse und deren jeweilige Absorption auf der y-Achse nachzeichnen. Wenden Sie eine Standardkurvengleichung an, um die Probenproteinkonzentration zu berechnen. Um mit der Proteintrennung zu beginnen, fügen Sie jedem Volumen der Proteinprobe ein Volumen von 2x Ladefarbstoff hinzu.
Bei 90 Grad Celsius fünf Minuten erhitzen und sofort eine Minute auf Eis abkühlen. 10 bis 20ug Proteinproben auf 10 Prozent SDS-Polyacrylamid-Gel laden und bei 100 bis 150V trennen. Übertragen Sie das Protein aus dem Gel auf eine 0,5 Mikrometer Nitrocellulosemembran mit einem halbtrockenen Transferinstrument.
Füllen Sie mit Transferpuffer bei 25V für 30 Minuten. Legen Sie die Membran nach dem Transfer in einen Behälter und fügen Sie eine Blockierlösung hinzu, bis die Membran vollständig eingeweicht ist, und bebrüten sie bei Raumtemperatur 30 Minuten lang mit Schütteln. Fügen Sie den entsprechenden Antikörper in die blockierende Lösung und gießen Sie über die Membran.
Hybridisieren, indem Sie die Membran 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrüten, während sie schüttelt. Waschen Sie die Membran nach der Hybridisierung, indem Sie den 1x TBST-Puffer bei Raumtemperatur fünf Minuten lang hinzufügen, und wiederholen Sie zwei weitere Male. Führen Sie die nächste Hybridisierung mit einem sekundären Antikörper durch, der in einer blockierenden Lösung über der Membran verdünnt wird, bei Raumtemperatur für 30 Minuten beim Schütteln.
Waschen Sie dann die Membran, indem Sie den 1x TBST-Puffer fünf Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen, und wiederholen Sie zwei weitere Male. Übertragen Sie die Membran in eine Box, die mit zwei ml HRP-verbessertem ECL-Reagenzmix gefüllt ist. Bedecken Sie die Box mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie die Membran vorsichtig aus der ECL-Reagenzmischung und setzen Sie sie mit einem Lumineszenz-Bildgebungsinstrument aus. Um die Wirkung von SINEUP-GFP in Zellen durch Bildgebung zu analysieren, waschen Sie die pEGFP-C2 und SINEUP-GFP transektierten Zellen aus der zweiten 24 Wellplatte mit 0,5 ml PBS pro Brunnen. Um den Kern zu färben, fügen Sie 2ug von Hoechst-33342 zu jedem Brunnen hinzu und brüten Zellen bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten.
Verwenden Sie ein Mikrowell-Zytometer mit hohem Durchsatz, um Hoechst-gefärbte Zellen zu messen, um die Gesamtzahl der Zellen zu zählen. Messen Sie die Intensität der grünen Fluoreszenz, um die Anzahl der GFP-positiven Zellen zu zählen. Zur Analyse der Protein-Upregulator-Wirkung der SINEUPs verwenden Sie Bildgebungssoftware, um eine gfP-integrierte Intensität zu bestimmen Berechnen Sie sie als Summe aller Pixelintensitäten, die Signale in segmentierten Objekten anzeigen, die für jeden Kanal erhalten wurden.
Nach erfolgreicher Transfektion mit SINEUP-GFP, einem synthetischen SINEUP, der sowohl eine optimale Bindungsdomäne als auch eine Effektordomäne GFP enthält, wurde die mRNA-Translation hochreguliert, ohne die Expression von GFP mRNA zu verändern. Ein Protokoll der halbautomatischen Bildanalyse verbesserte die Erkennungszeit und erhöhte die Anzahl der gleichzeitig abgeschirmten Proben im Vergleich zu einer herkömmlichen Western-Blot-Analyse. Obwohl es einen Unterschied in der Signalintensität gab, von 2,6-fach in der Western Blot-Analyse bis zum 1,4-fachen in der Bildgebungsanalyse, wurden im Vergleich zur Kontrolle signifikant höhere GFP-Fluoreszenzwerte festgestellt.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die richtige Reihenfolge der Ziel-mRNAs zu identifizieren, um die richtige Bindungsdomäne zu entwerfen. Gene werden oft von Promotern transkribiert und können verschiedene Übersetzungsinitiierungs-Website verwenden. Der Zenbu Browser ist ein sehr nützliches Werkzeug, um solche mRNA Varianz zu erkunden.
Wir schlagen vor, auch verschiedene SINEUPs mit variablen Bindungsstellen zu entwerfen. Insgesamt glauben wir, dass eine schnelle Anpassung der SINEUPs an eine Vielzahl von Zielen ein neues Feld schaffen wird, das in einer positiv regulierten Übersetzung bestehender RNAs besteht, was eine wechselseitige und ergänzende für das SiRNA-Feld ist. Ein Teil dieser Funktion, den wir vorstellen, dass diese Technologie entscheidend sein wird, um größere Mengen an Proteinen in vitro zu produzieren, wie Bioreaktoren, sowie in vivo, um die Gendosis natürlich zu korrigieren.
