Die Darm-Blut-Barriere ist ein mehrschichtiges System, das den Durchgang von Nährstoffen, bakteriellen Metaboliten, Medikamenten und anderen exogenen Verbindungen vom Darmlumen in den Blutkreislauf steuert. Wie wir wissen, kann die Integrität der Barriere sowohl im Magen-Darm-Bereich als auch bei Herz-Kreislauf- und einigen Stoffwechselerkrankungen beeinträchtigt werden, was zu einem leichteren Zugang biologisch aktiver Verbindungen wie Darmbakterienmetaboliten in den Blutkreislauf führen und die Funktion des gesamten Organismus beeinträchtigen kann. Daher kann die Durchlässigkeit der Darm-Blut-Barriere ein Marker für Darm- und Extradarmerkrankungen sein.
In diesem Video stellen wir eine direkte Messung der Darm-Blut-Barriere-Permeabilität bei Ratten mit Portal-Blutentnahme nach Verabreichung einer Testsubstanz in den Verdauungstrakt. Wir beschreiben detailliert die Kategorisierung der Portalvene und der minderwertigen Vena cava knapp über dem Lebervenenzusammenfluss. Blutentnahme aus Portalvene und minderwertige Vena cava ermöglicht nicht nur die Darm-Blut-Barriere Durchlässigkeit zu bewerten, sondern auch eine Leber-Clearance und Absorptionsweg von Molekülen von Interesse wie Darmbakterien Metaboliten oder Medikamente.
Diese Methode wird praktisch nicht durch Leber- und Nierenfunktion beeinflusst und bewahrt den Darmblutfluss, der ein starker Vorteil gegenüber häufig verwendeten In-vivo- und In-vitro-Methoden ist. Tiere sollten über Nacht vor dem Eingriff gefastet werden. Führen Sie alle Eingriffe während der Vollnarkose durch.
Tiere werden nach dem Experiment eingeschläfert. Unser Verfahren beginnt mit dem Einsetzen der Linie für die Darmverabreichung. Hier schlagen wir die intrakolonische Verabreichung von Markern vor.
Es kann durch die Verabreichung auf verschiedenen Ebenen des Verdauungstraktes modifiziert werden. Zum Beispiel Magen oder Zwölffingerdarm. Berücksichtigen Sie jedoch die variable Geschwindigkeit der Peristaltik und mögliche Wechselwirkungen mit Enzymen und Magensäuren, während Sie einen Marker in die oberen Teile des Magen-Darm-Traktes verabreichen.
Verwenden Sie pädiatrischen Foley-Katheter Größe 10 F oder 8 F als Kolonkatheter. Markieren Sie den Katheter, um den Teil anzugeben, der etwa acht Zentimeter in den Doppelpunkt eingefügt wird. Überprüfen Sie den Analbereich und die Anzahl der Hocker im Rektum, bevor Sie den Katheter in den Doppelpunkt einfügen.
Wenn die Hocker vorhanden sind, leeren Sie das Rektum, indem Sie den rektalen Bereich massieren. Legen Sie ein Schmiermittel entlang des Katheters. Als nächstes befeuchten Sie den Anus und seine Umgebung mit einem Schmiermittel.
Setzen Sie den Katheter mit einem Führungsdraht durch den externen Analschließer ein. Machen Sie langsamvorwärts, rückwärts und kreisförmige Bewegungen. Überprüfen Sie die Position des Katheters durch Bauchpalpation beim Einsetzen des Katheters.
Der nächste Schritt ist die minderwertige Vena cava Katheterisierung. Sie können dieses Verfahren in Darmdurchlässigkeitsstudien überspringen. Versuchen Sie, den Puls auf der Oberschenkelarterie zu fühlen und schneiden Sie die Haut längs für die Länge von etwa zwei Zentimetern an der Stelle, wo der Puls spürbar ist.
Sezieren Sie die Faszien und Muskeln, um das neurovaskuläre Bündel zu visualisieren. Als nächstes sezieren Sie die femorale Vene aus dem neurovaskulären Bündel. Erst Nerven, dann die Oberschenkelarterie und dann die Vene.
Seien Sie vorsichtig während der Zerlegung des Bündels, da mehrere winzige Zweige der Oberschenkelvene leicht beschädigt werden können. Als nächstes setzen zwei Ligaturen auf die Femoral Vene. Binden Sie die Knoten noch nicht.
Fangen Sie die Enden der proximalen Ligatur mit einem Nadelhalter. Ziehen Sie dann vorsichtig die Ligaturen mit dem Halter nach oben, um den proximalen Teil der Vene zu schließen. Warten Sie, bis die Vene mit Blut gefüllt ist und binden Sie den distalen Knoten.
Als nächstes machen Sie einen kleinen Schnitt auf der Vene zwischen dem Knoten und der proximalen Ligatur mit einer mikrochirurgischen Schere. Dann legen Sie den Katheter mit einer Pinzette oder einer Nadel mit einem gekrümmten Ende ein, wie wir es im Video tun. Punktieren Sie die Vene und verwenden Sie die gebogene Spitze der Nadel als Führung für den Katheter.
Lösen Sie die proximale Ligatur beim Einsetzen des Katheters. Legen Sie den Katheter je nach Größe eines Tieres etwa sechs bis sieben Zentimeter ein, um die proximale Spitze des Katheters in die untere Vena cava direkt über dem Lebervenenzusammenfluss zu platzieren. Die richtige Platzierung des Katheters sollte nach dem Experiment bestätigt werden.
Sichern Sie den Katheter in der Femoralvene mit zwei einzelnen chirurgischen Knoten. Binden Sie auch die proximale Ligatur. Überprüfen Sie die Durchgängigkeit des Katheters, indem Sie versuchen, Blut mit einer Spritze zu ziehen.
Spülen Sie den Katheter mit 0,3 Millilitern der heparinisierten Saline. Schließen Sie die chirurgische Wunde mit zwei Schichten von Einzelstichen. Nun geht es weiter zur Portalvenenkatheterisierung.
Bereiten Sie den Portalkatheter vor. Es besteht aus einer Nadel, flexiblem Polyurethankatheter, flexibler Polyethylenspitze des Katheters, Steckers und der Ligatur. Der erste Schritt des Verfahrens ist die Durchführung einer Mittellinien-Laparotomie.
Nach der Vorbereitung des Operationsfeldes die Haut längs vom Xiphoid des Brustbeins bis zum Nabel schneiden. Schneiden Sie die Muskeln der Bauchwand entlang der weißen Linie. Als nächstes erweitern Sie den Schnitt rostral in der y-Form, so dass der xiphoide Knorpel zwischen zwei Schnitten liegt.
Der nächste Schritt ist die Portalvenensektion. Zuerst befeuchten Sie die Tupfer mit Saline. Und dann exteriorisieren das Cecum, aufsteigenden und transversalen Dickdarm, und Dünndarmschleife.
Legen Sie den Darm auf der linken Seite, um die Wurzel der Mesenterie zu entlarven. Bedecken Sie den Darm mit Gaze befeuchtet mit einer physiologischen Salzlinie, um sie vor dem Trocknen zu schützen. Um die Portalvene vorsichtig zu belichten, bewegen Sie die Leberlappen an den Seiten oder nach oben in Richtung Deswerchfell mit den befeuchteten Tupfern.
Hier können wir die Portalvene und die obere mesenterische Vene sehen. Lokalisieren Sie den Teil der Portalvene, der nicht mit dem Mesentery abgedeckt ist, und übergeben Sie die Ligatur unter der Portalader. Um Gewebe vor Beschädigungen zu schützen, befeuchten Sie die Ligatur mit einer physiologischen Salzlösung.
Klemmen Sie mit Zange die Enden der Ligatur und ziehen Sie es sanft, um das Gefäß zu stabilisieren. Passieren Sie den längeren Teil der Katheterligatur unter dem freien Teil der Portalvene und ziehen Sie ihn so, dass sich der Katheter direkt neben der Portalvene befindet. Setzen Sie die Nadel in die obere mesentäre Vene drei Millimeter unter der Kreuzung von oberen mesentischen Venen und Portalvene.
Halten Sie die Nadel in einem 30-Grad-Winkel und nach dem Eindringen in die Vene reduzieren Sie den Winkel und bringen Sie die Nadel fast horizontal parallel zur Portalvene für eine Länge von etwa sechs bis sieben Millimetern vor. Tragen Sie einen oder zwei Tropfen Gewebekleber an der Stelle auf, an der die Nadel eingesetzt wird. Entfernen Sie die Tupfer, die die Leber bedeckt.
Danach legen Sie den Darm wieder in die Bauchhöhle. Befeuchten Sie den Darm mit einer aufgewärmten Herz-Darm-Lösung und bedecken Sie ihn mit einer befeuchteten sterilen Gaze. Überprüfen Sie die Durchgängigkeit des Katheters und spülen Sie den Katheter mit heparinisierter Saline ab.
Venöses Blut fließt spontan in den Katheter zurück. Nach fünf Minuten überprüfen Sie die Farbe des Darms und peristaltische Bewegungen, um sicherzustellen, dass die richtige mesenterische Durchblutung beibehalten wird. Schließen Sie am Ende die Bauchhöhle mit drei Stichschichten, die den distalen Teil des Katheters um den Nabel ausstechen.
Um Blut aus der Portalvene zu sammeln, öffnen Sie den Portalkatheterstecker und lassen Sie das Blut frei fließen. Verwenden Sie eine Spritze und eine stumpfe Nadel und sammeln Sie nicht mehr als 0,7 Milliliter Blut. Spülen Sie den Katheter mit heparinisierter Saline und schließen Sie den Katheterstecker.
Hier stellen wir beispielhafte Portal-Blutentnahmeprotokolle zur Darmdurchlässigkeitsbeurteilung vor. Blutproben aus der unteren Vena cava sind für Leberfreiungs- und Absorptionsstudien notwendig. Um Blut aus der unteren Vena cava zu sammeln, gehen Sie genau so vor, wie wenn Sie Blut aus der Portalvene nehmen.
Hier stellen wir Ihnen ein beispielhaftes Blutentnahmeprotokoll zur Leberablichtmessung und zur Verfolgung des Darmportals Blut-Leber-systemischen Blutweg simonere ausgewählte Verbindungen vor. In unseren Studien verwendeten wir einen bakteriellen Metaboliten, Trimethylamin als Marker der Permeabilität. Es können jedoch auch viele andere Substanzen einschließlich Klassenpermeabilitätsmarker verwendet werden.
Verschiedene Bakterien und Metaboliten und Traktate können auch verwendet werden, um den Absorptionsweg oder Leberclearance zu traktieren. Entfernen Sie den Führungsdraht und blasen Sie den Ballon mit ausreichend Volumen sterilen Wasserin der Regel einen Milliliter, aber überprüfen Sie tatsächlich Ballongröße vor dem Einsetzen. Der Ballondurchmesser sollte einen Zentimeter nicht überschreiten.
Legen Sie den Rattenkopf nach unten, um das Risiko des Abflusses der verabreichten Lösung aus dem Dickdarm zu minimieren. Die getestete Substanz mit Drainageanschluss und Kolonkatheter langsam verabreichen. Wir verwendeten Trimethylamin in einer Dosis von 100 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht in 0,7 Milliliter Salin gelöst.
Nach zehn Minuten den Katheterballon entleeren. Die als Leberextraktion verstandene Leberclearance kann durch den Unterschied zwischen der Blutkonzentration des Portals und der niedrigeren Vena-Cava-Blutkonzentration oder durch das Verhältnis von minderwertiger Vena-Cava- und Portalblutkonzentration ausgedrückt werden. Wir haben erfolgreich die Durchlässigkeit der Darm-Blut-Barriere und die Leberclearance von Trimethylamin bei Ratten gemessen.
Hier sind die repräsentativen Ergebnisse, die zeigen, dass hypertensive Ratten haben Erhöhte Dickdarmdurchlässigkeit tMA im Vergleich zu normotensiven Ratten. In einer anderen Studie untersuchten wir, ob eine hohe Salzaufnahme die Durchlässigkeit der Darm-Blut-Barriere und die Leberclearance von Trimethylamin beeinflusst. Die intrakolonische Verabreichung von Trimethylamin führte zu einer signifikanten Erhöhung der TMA-Konzentration im Portalblut.
Die Größe der Erhöhung und die Leberabstand waren zwischen den Gruppen ähnlich. Wir verfolgten auch den Absorptionsweg von kurzkettigen Fettsäuren. Wir haben die Konzentration in Stuhl, Portalblut und peripherem Blut gemessen.
In diesem Video beschrieben wir ein umfassendes Protokoll, das die direkte Messung der Darm-Blut-Barriere-Permeabilität in vivo umfasst, die im Gegensatz zu gängigen Methoden nicht durch Leber- und Nierenfunktionen, Leberabstandsmessung und drittens die Bewertung des Absorptionswegs von exogenen Verbindungen beeinflusst wird. Die vorgestellte Technik kann an andere versuchszwecke angepasst werden. Zum Beispiel Portal Blutdruckmessung oder Medikamentenverabreichung direkt an die Portalvene.
