Die Autoren möchten Thankthe Jenkins-Mikroskopie-Anlage an der University of Wyoming für ihre Hilfe und die Mitglieder des Bushman Lab, Kelly Roballo, Hayden wahr, Wupu Osimanjiang und Subash Dhunghana, um Unterstützung bei der Pflege der Tiere. Diese Publikation wurde durch eine institutionelle Development Award (IDeA) aus dem National Institute of General Medical Sciences von den National Institutes of Health unter Grant # 2P20GM103432 ermöglicht.

Erwachsene Sprague-Dawley Ratten wurden in diesem Projekt verwendet und alle Verfahren wurden von der University of Wyoming institutionelle Tierpflege und Use Committee genehmigt.
1. Chirurgie und In Vivo -Nerv-Fixierung
Hinweis: Herstellerinformationen für alle Materialien und Geräte verwendet, die in diesem Protokoll finden Sie in der Tabelle der Materialien.
Hinweis: In Vivo Nerv Fixierung wird verwendet, um das Gewebe zu bewahren und reduzieren strukturelle Verschlechterung, die zwischen dem Zeitpunkt des Todes und Sammlung der Nerven auftreten können. In Vivo Gewebe Fixierung ist ein Standardverfahren für die Vorbereitung des Nervensystems Gewebe für Histologie, wo die Perfusion ist oft eine Vorstufe dazu. Die Anordnung und Größe der peripheren Nerven, die für in-situ Fixierung erlaubt. Wir empfehlen nicht Sammlung und Fixierung des Gewebes nach Euthanasie durch die Möglichkeit der Schädigung von Gewebe.
<ol><li>Die Ratte für die Vollnarkose vorbereiten, indem man sie in eine Kammer Induktion mit 2-3 % Isofluran, dann die narkotisierten Ratte in Bauchlage auf der Oberseite eine Dissektion Matte und auch bleiben bei 1-2 % der Isofluran über Narkose bugnase. Um ausreichende Tiefe der Narkose zu gewährleisten, testen Sie Tiere für Pedal Rückzug auf die Hinterfüße zu und überprüfen Sie das Fehlen von palpebrale Reflexe an den Augen durch Berühren der medialen Augenwinkel des Auges. Hinweis: Intraperitoneale Injektion von Ketamin ist eine häufig verwendete Alternative zu inhalierten Isofluran.</li>
	<li>Um den Ischiasnerv freizulegen, rasieren Sie die Haare von den Hind limb(s) und reinigen Sie die rasierten Bereiche mit 70 % Ethanol. Mit einem Skalpell oder einer Schere, machen einen 2-3 cm Einschnitt in die Haut entlang der hinteren Gliedmaßen vom Knie bis zu den Trochanter Major, wo Palpation des Oberschenkelknochens mit dem sterilen Skalpell um die richtige Position des Schnittes zu gewährleisten. Das Femur befindet sich nur auf das zugänglichste Segment des Nervus ischiadicus proximal. Obwohl dies eine Operation nicht überleben wird, pflegen Sie sterile Techniken.</li>
	<li>Nach dem vornehmen der hautinzision, suchen Sie das Flugzeug zwischen den Muskel Bizeps Femoris und den Musculus Muskel, und mit Mikrodissektion Schere trennen die zugrunde liegenden Faszie und setzen 2-3 cm des Nervus ischiadicus unterstreichen. Um eine klare Abschnitt des n. ischiadicus verfügbar zu machen, verwenden Sie einen Retraktor, um die Kluft zwischen den beiden Muskeln (Abbildung 1A) zu vergrößern. Trennen Sie mit feinen Zangen und Iris Schere vorsichtig den Nerv aus den umliegenden Bindegewebes, unter größter Sorgfalt nicht zu komprimieren oder Schnitten den Nerv.</li>
	<li>Fügen Sie ausreichend Trump Fixativ (4 % Formaldehyd, 1 % Glutaraldehyd mit 1 X PBS-Puffer (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) mit 1,16 g NaH2PO4· H2O pro 100 mL) in den Hohlraum mit exponierten Nervs Nervus abdecken und 10 Minuten ruhen lassen. Wenn nötig, Platz Gaze unter der Hind Bein, um den Winkel zu verbessern, so dass mehr Fixiermittel in den Hohlraum hinzugefügt werden kann. Entfernen Sie das Fixiermittel nach 10 Minuten und wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.</li>
	<li>Mit einem sezierenden Mikroskop schnitten den Nerv von beiden Seiten mit feinen Dissektion Schere, sicherstellen, dass nicht zu dehnen oder zu kneifen der Ischiasnerv und sofort die Nerven-Abschnitte in 15 mL Röhrchen mit Trumps Fixiermittel bei 4 ° C für eine Woche, Ändern der Fixiermittel alle 48 h.</li>
	<li>Nicht unbeaufsichtigt lassen Tiere während eines Teils des chirurgischen Eingriffs. Nach der Entfernung des Nervs einschläfern Sie Tiere durch zervikale Dislokation unter Narkose.</li>
</ol>(2) Osmium ausgefällt Behandlung und Harz einbetten
<ol><li>Post-Fixierung, sorgfältig entfernen Sie alle verbleibenden Fett und Bindegewebe vom Nerv und mit einem scharfen Skalpell schnitten den Nerv in Segmente ca. 5 mm in der Länge (Nerv Segmente getrennt und in verschiedene Leitungen gekennzeichnet werden können). Bereiten Sie frische 2 % Osmium ausgefällt in Trumps Fixativ Lösung verdünnt und halten in einer Glasröhre. Tauchen Sie Nerven Segmente in 2 % Osmium ausgefällt für 2 h, die im Kunststoff-Rohre für diesen kurzen Zeitraum der Zeit sein kann. Hinweis: Einige Kunststoffrohre reagieren mit Osmium ausgefällt, verursacht eine Verdunkelung der Lösung, daher längerer Lagerung von Osmium ausgefällt in Kunststoffrohren nicht empfohlen.</li>
	<li>Mit einer Epoxy Einbettung mittlere Kit, bereiten Sie die endgültige Einbettungs-Formel:<ol>
<li>Mischen Sie das Epoxidharz einbetten Medium mit DDSA-Lösung (Dodecenylsuccinic-Anhydrid; Mischung A) und mischen Sie das Epoxidharz einbetten Medium mit NMA-Lösung (Methylnadic-Anhydrid; Mischung B). Lassen Sie beide Mischungen, die A und B mindestens 20 min durch Rühren mit einem Magnetrührer mischen.</li>
		<li>Unmittelbar vor der Anwendung mischen Sie A und B-Mischung und fügen Sie das Gaspedal DPM-30 (2,4,6-tris(dimethylaminomethyl)phenol) im Verhältnis von 1,5 bis 2,0 % des Gesamtvolumens des Gemisches. Beachten Sie, dass die DPM-30 Lösung gemessen werden sollte, gerade um zu verhindern, dass den Block immer dunkel in der Farbe und spröde. Alle Harz-Chemikalien sind giftig; seien Sie besonders vorsichtig, Hautkontakt oder Inhalation zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit 1,5 mL-Tuben, Nerv Segmenten mit PBS waschen und die Austrocknung zu starten, indem man die Nerv Segmenten in verschiedenen Aceton/destilliertes Wasser Passagen: 30 %, 60 %, 90 %, Konzentrationen für 10 min, dann in 100 % Aceton 3 Mal für 10 Minuten.  Beachten Sie, dass Ethanol anstelle Aceton verwendet werden kann.</li>
	<li>Platzieren Sie für Harz Infiltration den Nerv Segmenten in einer Mischung aus 1 Teil der abschließenden Einbettung Mischung und 1 Teil 100 % Aceton für 30 min, dann in einer Mischung aus 2 Teilen der abschließenden Einbettung Mischung und 1 Teil 100 % Aceton für 30 min , und schließlich der Nerv im Finale Segmenten Platz Einbettung Mischung für 30 Minuten.</li>
	<li>Silikon-Kautschuk Einbettung Formen die Nerv Segmenten umgesetzt (wir haben 106 mm Länge x 71 mm Breite x 7 mm Tiefe verwendet; Blocklänge Größe 11 mm x 6 mm Breite x 3 mm Tiefe). Fügen Sie sanft das Harz auf die Nerven, und achten Sie auf decken die gesamten Nerv Segmenten und verhindern, dass Luftblasen. Lassen Sie die Form mit Nerv Segmenten mit dem Harz über Nacht bei 60 ° C polymerisieren.</li>
</ol>3. Schnitt durch regungsloses
<ol><li>Bereiten Sie Glas Messer mit einer Glas-Messermacher (Abbildung 1 b) und machen Sie Glas Messer mit Booten (Abbildung 1), die verwendet werden, auf das destillierte Wasser schwimmenden Nerv zu sammeln.</li>
	<li>Ort Harz eingebettet Nervenblockaden in regungsloses Halter mit der trapezförmige Seite nach oben. Mit regungsloses Rahmen, kein überschüssiges Harz rund um das Nervengewebe zu trimmen, und den Block eine Trapezform Gesicht und möglichst nahe an der längs-Oberfläche des Nervs wie möglich mit einer einseitig geschliffenen Klinge wie eine Rasierklinge. Dringen Sie nicht längs Oberfläche des Segments Nerv, die erkennbar durch seine dunkle Färbung von Osmium ausgefällt. Hinweis: Trimmen des überschüssigen Harzes verringert sich das Gebiet des Harzes werden geschnitten und Leistung der Blade und schneiden in den nachfolgenden Schritten verbessern.</li>
	<li>Mit der regungsloses stellen Sie mehrere Querschnitte ausreichend, um eine gleichmäßige Querschnitt Oberfläche des Nervengewebes mit einem einfachen Glas-Messer verfügbar zu machen. Sobald dies geschehen ist, wechseln Sie zu einem Glas Messer, dessen Schiff mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gefüllt ist, und passen Sie die regungsloses, 1-2 μm dünne Abschnitte geschnitten.</li>
	<li>Übertragen Sie schwimmende Dünnschliffe aus dem Glas-Messer-Boot zu einem Rückgang von entionisiertem Wasser auf Objektträger mit Metallöse (Abbildung 1). Trocknen Sie Folien mit Abschnitten, indem man mehrere Male über einer Flamme für ein paar Sekunden, und achten Sie nicht auf die Abschnitte zu überhitzen. Getrocknete Teile sofort mit Toluidin blauer Fleck oder für mehrere Tage vor der Färbung bei Raumtemperatur lagern. Hinweis: Abschnitte können auch mit einer Warmhalteplatte bei 60 ° C für 15 min getrocknet werden. Eine langsame Trocknung macht die Abschnitten glatt.</li>
</ol>4. Toluidin blauer Färbung
<ol><li>Bereiten Sie 1 % ige Lösung von Toluidin blau durch 2 g Natrium Borat in 100 mL entionisiertem Wasser auflösen dann fügen Sie 1 g Toluidin blau hinzu und rühren Sie, bis aufgelöst. Filtern Sie die Lösung mit Filterpapier (Porengröße: 11 µm) und halten Sie die Lösung in eine undurchsichtige Flasche bei Raumtemperatur bis zu zwei Wochen.</li>
	<li>Mit einem Kunststoff-Pipette oder Mikro-Pipette, einen Tropfen Toluidin blau Lösung oben auf der Nerv-Abschnitte und lassen für 20-30 s.</li>
	<li>Spülen Sie alle überschüssige Toluidin blau-Lösung durch die Folien in entionisiertem Wasser Glas sanft eintauchen und wiederholen Sie 3-4 Mal, bis Abschnitte klar sind. Trocknen Sie die Folien mindestens 15 min bei 60 ° C oder über Nacht bei Raumtemperatur und dann bedecken Sie die Abschnitte mit einem deckgläschen mit regelmäßigen Eindeckmedium. Untersuchen Sie die gerahmten Dias sofort oder bei Raumtemperatur lagern.</li>
	<li>Überprüfen Sie unter einem Lichtmikroskop. A 100 X Öl Immersion-Objektiv empfiehlt sich für detaillierte Bilder verwendet, um g-Werte zu berechnen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zacchigna, S., Ruiz de Almodovar, C., Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similarities+between+angiogenesis+and+neural+development:+What+small+animal+models+can+tell+us.">Similarities between angiogenesis and neural development: What small animal models can tell us.</a> Current Topics in Developmental Biology. 80, 1-55 (2008).</li><li>Grinsell, D., Keating, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve+reconstruction+after+injury:+A+review+of+clinical+and+experimental+therapies.">Peripheral nerve reconstruction after injury: A review of clinical and experimental therapies.</a> BioMed Research International. 2014, 1-13 (2014).</li><li>Chen, M. B., Zhang, F., Lineaweaver, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+fillers+in+nerve+conduits+for+peripheral+nerve+repair.">Luminal fillers in nerve conduits for peripheral nerve repair.</a> Annals of Plastic Surgery. 57 (4), 462-471 (2006).</li><li>Scipio, F., Raimondo, S., Tos, P., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+paraffin-embedded+myelin+sheath+staining+with+osmium+tetroxide+for+light+microscope+observation.">A simple protocol for paraffin-embedded myelin sheath staining with osmium tetroxide for light microscope observation.</a> Microscopy Research and Technique. 71, 497-502 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5:+Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+part+II-morphological+techniques.">Chapter 5: Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: part II-morphological techniques.</a> International Review of Neurobioly. 87, 81-103 (2009).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Campos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+myelin+sheath+and+collagen+reorganization+pattern+in+a+model+of+peripheral+nerve+regeneration+using+an+integrated+histochemical+approach.">Evaluation of myelin sheath and collagen reorganization pattern in a model of peripheral nerve regeneration using an integrated histochemical approach.</a> Histochemistry and Cell Biology. , 709-717 (2011).</li><li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue:+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility.">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16, 251-255 (2012).</li><li>Epstein, J. B., Scully, C., Spinelli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toluidine+blue+and+Lugol's+iodine+application+in+the+assessment+of+oral+malignant+disease+and+lesions+at+risk+of+malignancy.">Toluidine blue and Lugol's iodine application in the assessment of oral malignant disease and lesions at risk of malignancy.</a> Journal of Oral Pathology &amp; Medicine. 21, 160-163 (1992).</li><li>Carriel, V., Garzon, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+assessment+in+peripheral+nerve+tissue+engineering.">Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering.</a> Neural Regeneration Research. 9, 1657-1660 (2014).</li><li>Dykstra, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A manual of applied techniques for biological electron microscopy. , 257 (1993).</li><li>Vleggeert-Lankamp, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+evaluation+methods+in+the+assessment+of+peripheral+nerve+regeneration+through+synthetic+conduits:+A+systematic+review.">The role of evaluation methods in the assessment of peripheral nerve regeneration through synthetic conduits: A systematic review.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (6), 1168-1189 (2007).</li><li>Williams, P., Wendell-Smith, C. P., Finch, A., Stevens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+uses+and+methods+of+processing+of+fresh+frozen+sections+of+peripheral+nerve.">Further uses and methods of processing of fresh frozen sections of peripheral nerve.</a> Journal of Cell Science. 3 (69), 99-105 (1964).</li><li>Castro, J., Negredo, P., Avenda&#241;o, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+composition+of+the+rat+sciatic+nerve+and+its+modification+during+regeneration+through+a+sieve+electrode.">Fiber composition of the rat sciatic nerve and its modification during regeneration through a sieve electrode.</a> Brain research. , 65-77 (2008).</li><li>Raimondo, S., Fornaro, M., Di Scipio, F., Ronchi, G., Giacobini-Robecchi, M. G., Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+protocols+in+peripheral+nerve+regeneration+experimental+research:+Part+II-morphological+techniques.">Methods and protocols in peripheral nerve regeneration experimental research: Part II-morphological techniques.</a> International review of neurobiology. 87, 81-103 (2009).</li><li>Bozkurt, A., Lassner, F., O'Dey, D., Deumens, R., B&#246;cker, A., Schwendt, T., Janzen, C., Suschek, C. V., Tolba, R., Kobayashi, E., Sellhaus, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microstructured+and+interconnected+pore+channels+in+a+collagen-based+nerve+guide+on+axonal+regeneration+in+peripheral+nerves.">The role of microstructured and interconnected pore channels in a collagen-based nerve guide on axonal regeneration in peripheral nerves.</a> Biomaterials. 33 (5), 1363-1375 (2012).</li><li>Weis, J., Brandner, S., Lammens, M., Sommer, C., Vallat, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+nerve+biopsies:+A+practical+guide+for+neuropathologists.">Processing of nerve biopsies: A practical guide for neuropathologists.</a> Clinical Neuropathology. 31 (1), 7-23 (2012).</li><li>Battiston, B., Tos, P., Geuna, S., Giacobini-Robecchi, M. G., Guglielmone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+repair+by+means+of+vein+filled+with+muscle+grafts.+II.+Morphological+analysis+of+regeneration.">Nerve repair by means of vein filled with muscle grafts. II. Morphological analysis of regeneration.</a> Microsurgery. 20 (1), 37-41 (2000).</li><li>Bhattacharyya, T. K., Thomas, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+staining+methods+for+resin-embedded+peripheral+nerve.">Comparison of staining methods for resin-embedded peripheral nerve.</a> Journal of Histotechnology. 27, 161-164 (2004).</li><li>Zbaeren, J., Zbaeren-Colbourn, D., Haeberli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+immunohistochemistry+on+improved+glycol+methacrylate-resin+sections.">High-resolution immunohistochemistry on improved glycol methacrylate-resin sections.</a> Journal of Histotechnology. 30 (1), 27-33 (2007).</li><li>Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+stains:+A+literature+review+and+case+study.">Histological stains: A literature review and case study.</a> Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2016).</li><li>Ezra, M., Bushman, J., Shreiber, D., Schachner, M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+and+nonporous+nerve+conduits:+the+effects+of+a+hydrogel+luminal+filler+with+and+without+a+neurite-promoting+moiety.">Porous and nonporous nerve conduits: the effects of a hydrogel luminal filler with and without a neurite-promoting moiety.</a> Tissue Engineering Part A. (9-10), 818-826 (2016).</li><li>Bhatnagar, D., Bushman, J. S., Murthy, N. S., Merolli, A., Kaplan, H. M., Kohn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+glue+as+a+stabilization+strategy+in+peripheral+nerve+repair+when+using+porous+nerve+guidance+conduits.">Fibrin glue as a stabilization strategy in peripheral nerve repair when using porous nerve guidance conduits.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 28 (5), 79 (2017).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte.

Untersuchungen der morphologischen Strukturen der periphere Nervenverletzung und Regeneration sind häufige Themen der Studie13. In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte, um Bilder in hoher Qualität für histologische Daten Quantifizierungen mit Ratte Ischias-Nervengewebe eingebettet in Harz Blöcken und gefärbt mit Toluidin blau zu erhalten. Diese Technik bietet ein Bild der Nerv Morphologie der Nervenregeneration durch Messung der Zahl von Axonen, Grad der Myelinisierung, Vorhandensein von infiltrative fibrotische Gewebe und die Nerven Gesundheit quantifiziert werden kann. Während die Bilder-Schnitt zeigen und Verarbeitung von unverletzten Nerven wie Proben, die gleichen Schritte und Materialien gelten für verletzten Nerven und Nerven mit Leitungen oder Gewebe regeneriert Transplantate, die Fixierung des Gewebes ist ausreichend20, 21.
Während aller Schritte des Protokolls unerlässlich sind, sind einige dieser Schritte eher zu schlechter Qualität Abschnitte oder Bilder führen. Nicht genügend Gewebe Austrocknung führen zu Löchern in den Nerv-Abschnitten (Abb. 5 b). Eine mögliche Erklärung ist die Mischbarkeit von Harz mit Wasser und überschüssiges Wasser in das Gewebe verhindert, dass Harz das Gewebe infiltrieren. Daher unbedingt ausreichend Zeit und die Verwendung von absoluten Aceton ordnungsgemäße Austrocknung Schritt zu gewährleisten. Obwohl wir in diesem Protokoll Aceton verwendet, kann auch Ethanol eingesetzt werden. Viele Harze sind jedoch nicht reaktiv mit Ethanol, so dass das Gewebe mit Propylenoxid, dienen als Übergang zwischen dem Ethanol Dehydrierung und Harz einbetten behandelt werden muss.
Aufgrund der Schlankheit der Abschnitte sollte Nerv Abschnitte vom Glas Messer auf den Objektträger übertragen mit großer Sorgfalt (Abbildung 5) erfolgen. 1-2 μm Abschnitte sind sehr zerbrechlich, und falsche Übertragung des Abschnitts könnte dazu führen, dass im Abschnitt zu brechen. Abschnitt mit einer Nadel in den zentralen Teil des Abschnitts abgeholt, Abschnitt ist anfällig für Falten in sich selbst und oft schwer zu entfalten, wenn auf die Folie übertragen werden. Verschiedene Werkzeuge verwendet werden, für die Übertragung des Abschnitts auf den Objektträger, einschließlich Nadeln und Schleifen, und jeder sollte getestet werden, für den jeweiligen Benutzer zu bestimmen, die den besten Transfer Ergebnisse zu erhalten. Für unsere Zwecke reduziert mit einer Schleife, die den gesamten Abschnitt stark umfassen könnte die Faltung der Abschnitte, wenn sie vom Glas Messer auf den Objektträger (Abbildung 1) übertragen wurden.
Im Allgemeinen ist die richtige Handhabung der Nerven unerlässlich, da Kompression der Nerven kann dazu führen, dass Risse in den Nerv Abschnitten (Abb. 5A) auftreten. Kompression von Nerven-Gewebe kann während der Übertragung von Nerv Segmenten in den Prozessen der Exposition im Tier, Fixierung, Dehydrierung und Harz einbetten passieren. Zur Vermeidung von Kompression von Nerven-Gewebe Nerven Segmente übertragen werden sollen, durch feine Pinzette und hob auf ein Ende des Segments idealerweise durch nur die epineurial Schicht, also der gesamte Nerv nicht beeinträchtigt wird. Das Vorhandensein von Rissen und Linien (Messer Marken) in den Nerv-Abschnitten kann auch durch Messer stumpf oder überstrapaziert Glas auftreten. Um optimalen Schnitt zu gewährleisten, empfehlen wir frischen Glas Messer zu machen und das Glas Messer alle 25-30 Schnitte, das weniger wenn durch Nerv eingehüllt in ein Installationsrohr-Schnitt ändern.
Harze kann relativ teuer werden, sind unzureichend, wenn längs-Nerven Abschnitte erforderlich sind und können teure Werkzeuge wie ein regungsloses und ein Glas Messermacher erfordern. Trotz dieser Einschränkungen Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet peripheren Nerven Abschnitte gilt immer noch der Goldstandard für die Visualisierung von Querschnitten von peripheren Nerven Morphometrie4,5. Längsprofile können auch wichtige Merkmale der peripheren Nerven, wie z. B. axonale Kontinuität und Knoten von Ranvier, zeigen aber eignet sich am besten mit Immunohistochemistry. In solchen Fällen ist es allgemein üblich, zwei Abschnitte des gleichen Nervs differentiell zu verarbeiten eine für Toluidin blau Querschnitte und die andere für längs-Immunohistochemistry. Durch erhöhte Inzidenz von peripheren Nerven Traumata und Verletzungen und die Bedürfnisse der einen besseren Weg zur Beurteilung morphologischer Nervenstrukturen kann diese Methode weiterhin als ein wichtiges Instrument zur histologische Daten von Nervenschäden und Regeneration zu gewinnen angewendet werden.

Periphere Nerven erstrecken sich im ganzen Körper, innervieren Zielgeweben mit motorischen oder sensorischen Axonen1. Periphere Nerven Mängel verursacht durch Erkrankungen und Trauma eine große Gesundheitsproblem darstellen und haben große wirtschaftliche Auswirkungen2,3. Trotz der Fortschritte bei der Bewertung der Ergebnisse der peripheren Nervenverletzungen und Verständnis Nervenregeneration sind traditionelle Methoden wie Nerven Histologie und Färbetechniken wesentliche Instrumente, um qualitativ und quantitativ Nerven Gesundheit bewerten als terminal Ausgang Maß in Tiermodellen oder ausgeschnittenen menschliches Gewebe. Dies ist oft mit elektrophysiologische Messungen der peripheren Nervenfunktion, gepaart wo Morphometrie offenbaren kann, warum funktionelle Nervenregeneration habe oder nicht auftreten.
Toluidin blauer Färbung der Harz eingebettet Semi-dünne periphere Nerven Abschnitte ist eine spezielle Methode für imaging Markhaltige Nervenfasern, qualitativ hochwertige und klare detaillierte Bilder von Nerv Strukturen4,5,6 . Toluidin blau ist ein acidophilen metachromatic Fleck, von William Henry Perkin im Jahre 18567, entdeckt und wurde in mehreren medizinischen Anwendungen8verwendet. Toluidin blau gefärbten peripheren Nerven Abschnitte gewonnenen Harz eingebettet Nerv Segmenten ermöglicht eine übersichtliche Visualisierung von Nervenstrukturen. Visualisierung der Myelinscheide Struktur kann durch die Verwendung von Osmium ausgefällt Post-Fixierung4,9verbessert werden. Osmium ausgefällt ist eine toxische Oxidationsmittel und Lipid Fixativ Agent, die Interaktion mit den Doppelbindungen in Lipiden, was zu krass definierten lipidreichen Myelinscheiden10. Jedoch Osmium ausgefällt ist giftig, teuer, erfordert eine längere Inkubationszeit der Nerv Segmenten und wird nicht immer verwendet.
Zur Visualisierung der peripheren Nerven Morphologie wurden alternative Methoden der Verarbeitung und Färbung entwickelt; Paraffin, Kryo-Schnitt und Epoxy-Harz eingebettet Nerv Schnitt gefolgt von Färbungen mit Toluidin blau oder Phenylendiamin Lösung verwendet wurde, um morphologische Veränderungen der peripheren Nerven Regeneration 11,12 zu quantifizieren . Jede dieser Methoden haben ihre vor- und Ertragsdaten wesentlich von der Anzahl der Axone, Myelin Dicke, Axon Durchmesser und Axon Durchmesser Markhaltige Faser Durchmesser (g-Wert) 11,13,14,15 .
Der primäre Unterschied der Harz-Einbettung in diesem Protokoll ist, dass es 1-2 μm Dicke Querschnitte aufgrund der Härte des Harzes erleichtert unter Beibehaltung der histologischen Eigenschaften des Nervs zu erhalten. Diese dünne Abschnitte, im Gegensatz zu den 4-5 μm Dicke Abschnitte von Paraffin einbetten, erhalten bieten peripheren Nerven Abschnitte mit höherer Auflösung, so dass für eine genaue Quantifizierung der Axon Myelinisierung, wie der g-Wert, die nicht aus dickeren Abschnitte16gewonnen. Während Kryo-Schnitt verwendet werden kann um 1-2 µm Abschnitte zu erhalten, ist es unserer Erfahrung gewesen, ist es schwieriger, ohne zahlreiche große Risse zu bekommen. Solche Risse Abschnitte kann ungenau zählen die Anzahl der Axone und Aspekte der Myelinisierung.
Neben Toluidin Blau Färbung17eine silberne Färbung Methode18 und Masson trichrome Färbung4 auch einsetzbar, Nervenzellen Axone zu zeigen. Jedoch gebeizt mit Harz Einbettung der Ratte n. medianus Abschnitte mit Hämatoxylin und Eosin oder Masson trichrome zeigte schwache Myelinscheiden und unbekannte Strukturen, während Toluidin blauer Färbung klar Myelinscheide Bild zeigte und kann leicht quantifizierte4sein. Trotz einiger Einschränkungen Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet peripheren Nerven ist eine wertvolle Technik, die verwendet werden kann, wenn Bilder mit hoher Auflösung der Nerv Morphologie erforderlich sind.
Der primäre Nachteil für die Einbettung von Harz ist, dass es zeitaufwendig ist und nicht für Immunostaining des gleichen Gewebes aufgrund der Schwierigkeiten der Antigen-Retrieval gegenüber Paraffin und eingebettete Gefrierschnitte Techniken zu ermöglichen. So kann es nicht im Allgemeinen das gleiche Gewebe für Immunostaining zu nutzen, die über Harz-Einbettung für Toluidin blauer Färbung verarbeitet wird. Obwohl nicht verwendet hier ggf. Immunohistochemistry im Harz eingebettete Abschnitte, die Verwendung von Glykol Methacrylat Einbettung Harze ermöglicht Immunohistochemistry Gewebeschnitte ausgeführt werden, aber es ist relativ teuer19. Dies kann etwas gemildert durch Einschneiden der peripheren Nervs, separate Segmente, einige für die Einbettung von Harz und andere für Immunostaining direkt nach der Fixierung.
Der Prozess der Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet periphere Nerven, wie mit die meisten histopathologische Analyse in fünf Stufen, einschließlich Fixierung, Austrocknung, einbetten, schneiden und färben20unterteilt werden kann. Hier wollen wir ein Protokoll und einen praktischen Leitfaden für die Verwendung von Harz eingebettete Ratte Ischiasnerv Abschnitte gebeizt mit Toluidin blau erwerben Bilder in hoher Qualität bieten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1092">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:216px;">Gibco</td>
			<td style="width:137px;">14200-075</td>
			<td style="width:384px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glutaraldehyde Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">G6257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Toluidine Blue O</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Tetraborate Decahydrate</td>
			<td style="width:216px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:137px;">205950010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:216px;">Piramal</td>
			<td style="width:137px;">NDC 66794-013-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Epoxy Embedding Medium Kit</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">45359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Hydroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">72068</td>
			<td>To adjust Trump&#39;s fixative pH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Acetone</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:137px;">170942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Osmium Tetroxide Solution</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">75632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">VWR Micro Slides, Superfrost Plus</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12545102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Pelco Embedding Cast</td>
			<td style="width:216px;">Fisher Scientific</td>
			<td>NC9671811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Glass Knife Maker</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">GKM-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Ultramicrotome</td>
			<td style="width:216px;">RMC Products</td>
			<td style="width:137px;">MT-XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">15 mL Conical Tube</td>
			<td style="width:216px;">Falcon</td>
			<td>ISO 9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">4 mL Glass Vial</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>854190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Razor Blades</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">55411-050</td>
			<td>For trimming resin block</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:355px;">Perfect Loop</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">70944</td>
			<td>For picking up thin resin sections</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:355px;">Ultra Glass Knife Strips 6.4 mm x 25 mm x 400 mm</td>
			<td style="width:216px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:137px;">71012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">100 Watt Oven</td>
			<td style="width:216px;">Millipore&#160;</td>
			<td style="width:137px;">6350115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Whatman Filter Paper</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>WHA10010155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">3 mL plastic pipette</td>
			<td style="width:216px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:137px;">Z331740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Micro-surgical Kit</td>
			<td style="width:216px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Olympus fluorescence microscope</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td>Dual CCD Color and Monochrome Camera, DP80</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toluidine blue staining of resin-embedded sections for evaluation of peripheral nerve morphology

Periphere Nerven erstrecken sich im ganzen Körper, innervieren Zielgeweben mit motorischen oder sensorischen Axonen. Aufgrund der weiten Verbreitung sind periphere Nerven häufig wegen Verletzung oder Krankheit beschädigt. Methoden und Strategien entwickelt wurden, um periphere Nervenverletzung in Tiermodellen, Funktion und Regeneration, bewerten analysieren die Morphometrie der peripheren Nerven ein wesentliches Ergebnis der terminal-Messung geworden ist. Toluidin blauer Färbung des Nervs Kreuz Abschnitte gewonnenen Harz eingebettet Nerv Abschnitte ist eine reproduzierbare Methode für die qualitative und quantitative Beurteilung der peripheren Nerven, ermöglicht die Visualisierung der Morphologie Anzahl der Axone und Grad der Myelinisierung. Diese Technik kann wie bei vielen anderen histologischen Methoden schwierig sein zu erlernen und zu beherrschen, mit schriftlichen Standardprotokolle. Die Absicht dieser Veröffentlichung ist daher um schriftliche Protokolle für Toluidin blauer Färbung der peripheren Nerven mit Videografie von der Methode, bei der Ischias Nerven geerntet von Ratten zu betonen. In diesem Protokoll beschreiben wir in Vivo peripheren Nerven Fixierung und Sammlung der Gewebe und Post-Fixierung mit 2 % Osmium ausgefällt, Einbettung von Nerven in Epoxidharz und regungsloses Nerven 1-2μm Dicke schneiden. Nerv Abschnitte dann auf einen Objektträger übertragen und gefärbt mit Toluidin blau, woraufhin sie quantitativ und qualitativ bewertet werden. Beispiele für die häufigsten Probleme sind sowie Schritte zur Eindämmung dieser Probleme angezeigt.

Harz eingebettet peripheren Nerven Abschnitte mit Toluidin blau gebeizt für genaue histologische Daten Quantifizierungen ermöglichen. Ein Überblick über das Verfahren zeigt (Abbildung 2). Ischias-Nerven-Abschnitte in Harz Medium eingebettet und befleckt mit Toluidin blau zeigte klare Bilder mit einer optimalen Auflösung (Abb. 3). Nervenschäden kann viele Veränderungen in Nervenzellen morphologische Strukturen, z. B. Veränderungen der Nervenfaser Axon Durchmesser und Dicke der Myelinscheide verursachen. Diese Methode kann Nerv Struktur in seiner natürlichen Form bewahren, die Messung verschiedener Parameter wie z. B. das Verhältnis von Axon Durchmesser an der gesamten Faserdurchmesser (g-Verhältnis erleichtert; ( Abbildung 4). Eine Vielzahl von Faktoren kann zu weniger als optimale periphere Nerven Abschnitte, einschließlich das Vorhandensein von Rissen (Abb. 5A) im Abschnitt durch unsachgemäße Handhabung des Nervs führen. Löcher können auch im Abschnitt (Abb. 5 b) durch unzureichende Austrocknung auftreten. Ein weiterer möglicher Fehler im Verfahren ist der Abschnitte (Abbildung 5), Falten, die durch Verwendung von Impfkeimen Schleifen für den Abschnitt Transfer auf den Objektträger behoben werden können.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig1.jpg"> Abbildung 1: Chirurgie und schneiden. (A) Ratte Ischiasnerv während in Vivo Fixierung. (B) Glas Messer Hersteller (C) Glas Messer mit Boot. (D) Metall Schleifen zur Übertragung schwebte Dünnschliffe aus Glas Messer zu einem Rückgang der deionisiertes Wasser auf Glasobjektträger. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig2.jpg"> Abbildung 2: der in diesem Protokoll verwendeten Methode schematische. (A) Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten betäubt ist, gefolgt von in Vivo Nerv Fixierung (B) und Nerven-Sammlung (C). Der nächste Schritt ist Post-Fixierung mit 2 % Osmium ausgefällt (D) und Harz einbetten (E). Eingebettete Nerv Abschnitte sind dann (F) gestutzt und geschnitten (G) mit einem regungsloses Harz. Zu guter Letzt Nerven, die Abschnitte auf Objektträger mit Toluidin gefärbt sind blau (H). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig3.jpg"> Abbildung 3: Querschnitt des ischiadicus eine Ratte mit Toluidin blau befleckt. Zeigt Abschnitte unter verschiedenen Vergrößerungen (10 X, 20 X, 40 X und 60 X) klares Bild mit optimalen Auflösung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig4.jpg"> Abbildung 4: Querschnitt des ischiadicus eine Ratte mit Toluidin blau befleckt. Das hochauflösende Bild (100 X) kann verwendet werden, um das Verhältnis von Axon Durchmesser an der gesamten Faserdurchmesser (der g-Wert) zu messen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58031/58031fig5.jpg"> Abbildung 5: Querschnitte von einer Ratte Ischiasnerv gebeizt mit Toluidin blau unter verschiedenen Vergrößerungen. Gezeigt, Aresome der Probleme, die auftreten, während der Leistung dieses Protokolls. (A) und (B). Das Vorhandensein von Rissen und Löchern im Abschnitt Nerv verursacht durch unsachgemäße Handhabung des Abschnitts und unzureichende Austrocknung des Gewebes, beziehungsweise. (C). Faltung der Abschnitte, die passieren kann, während die Abschnitte von der Glas-Messer zur Folie übertragen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58031/58031fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology at JoVE.com

Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die feinen Strukturen des peripheren Nerven visualisieren und 1-2 µm Abschnitte mit Toluidin blauer Färbung

Toluidin blauer Färbung Harz eingebettet Abschnitte für die Beurteilung der Morphologie der peripheren Nerven

Peripheral nerves extend throughout the body, innervating target tissues with motor or sensory axons. Due to widespread distribution, peripheral nerves ...

toluidine-blue-staining-resin-embedded-sections-for-evaluation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

18.7K Aufrufe.  University of Wyoming. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die feinen Strukturen des peripheren Nerven visualisieren und 1-2 µm Abschnitte mit Toluidin blauer Färbung

Serie: Toluidine Blue Staining of Resin-Embedded Sections for Evaluation of Peripheral Nerve Morphology

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Capture Mikrodissektion von Drosophila Peripheren Neuronen

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in which the enhanced version of the green fluorescent protein (EGFP) is exclusively expressed in all neurons of the developing central and peripheral nervous system1, allowing the possibility to both film the innervation of the forelimb and to manipulate this process with pharmacological and genetic techniques2. The most critical parameter in the successful cultivation of such slice cultures is the method by which the slices are prepared. After extensive testing of a variety of methods, we have found that a vibratome is the best possible device to slice the embryos such that they routinely result in a culture that demonstrates viability over a period of several days, and most importantly, develops in an age-specific manner. For mid-gestation embryos, this includes the normal outgrowth of spinal nerves from the spinal cord and the dorsal root ganglia to their targets in the periphery and the proper determination of skeletal and muscle tissue. 
In this work, we present a method for processing whole embryos of embryonic day (E) E10 to E12 into 300 - 400 micrometer slices for cultivation in a standard tissue culture incubator, which can be studied for up to two days after slice preparation. Critical for the success of this approach is the use of a vibratome to slice each agarose-embedded embryo. This is followed by the cultivation of the slices upon Millicell culture membrane inserts placed upon a small volume of medium, resulting in an interface culture technique. One litter with an average of 7 embryos routinely produces at least 14 slices (2-3 slices of the forelimb region per embryo), which varies slightly due to the age of the embryos as well as to the thickness of the slices. About 80% of the cultured slices show nerve outgrowth, which can be measured througout the culturing period2. Representative results using the tauGFP mouse line are demonstrated.

We present a method to prepare organotypic slices of mid-gestation mouse embryos for the cultivation and time-lapse imaging of peripheral nerve outgrowth.

Organotypischen Kultur der GFP-exprimierenden Maus Embryonen für Real-time Imaging der peripheren Nerven Outgrowth

For many purposes, the cultivation of mouse embryos ex vivo as organotypic slices is desirable. For example, we employ a transgenic mouse line (tauGFP) in ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Visualizing the Effects of a Positive Early Experience, Tactile Stimulation, on Dendritic Morphology and Synaptic Connectivity with Golgi-Cox Staining

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile stimulation is a positive early experience that mimics maternal licking and grooming in the rat. Exposing rat pups to this positive experience can be completed easily and cost-effectively by using highly accessible materials such as a household duster. Using a cross-litter design, pups are either stroked or left undisturbed, for 15 min, three times per day throughout the perinatal period. To measure the neuroplastic changes related to this positive early experience, Golgi-Cox staining of brain tissue is utilized. Owing to the fact that Golgi-Cox impregnation stains a discrete number of neurons rather than all of the cells, staining of the rodent brain with Golgi-Cox solution permits the visualization of entire neuronal elements, including the cell body, dendrites, axons, and dendritic spines. The staining procedure is carried out over several days and requires that the researcher pay close attention to detail. However, once staining is completed, the entire brain has been impregnated and can be preserved indefinitely for ongoing analysis. Therefore, Golgi-Cox staining is a valuable resource for studying experience-dependent plasticity.

This paper describes the procedures for tactile stimulation of rat pups and subsequent Golgi-Cox staining of neuronal morphology. Tactile stimulation is a positive experience that is administered in the perinatal period by stroking pups with a household duster. Golgi-cox staining is a reliable procedure permitting the visualization of entire neurons.

Visualisierung der Auswirkungen einer Früh Positive Erfahrung, taktile Stimulation, auf dendritischen Morphologie und synaptische Verbindungen mit Golgi-Cox Färbung

To generate longer-term changes in behavior, experiences must be producing stable changes in neuronal morphology and synaptic connectivity. Tactile ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the diagnosis still relies only on clinical signs of motor involvement that appear later on in the disease course, when most of the dopaminergic neurons are already lost. Hence, there is a strong need for a biomarker that can identify patients at the beginning of disease or at the risk of developing it. Over the last few years, skin biopsy has proved to be an excellent research and diagnostic tool for peripheral nerve diseases such as small fiber neuropathy. Interestingly, a small fiber neuropathy and alpha synuclein (&#945;Syn) neural deposits have been shown by skin biopsy in PD patients. Indeed, skin biopsy has the great advantage of being an easily accessible, minimally invasive and painless procedure that allows the analysis of peripheral nervous tissue prone to the pathology. Moreover, the possibility of repeating the skin biopsy in the course of the follow-up of the same patient allows studying the longitudinal correlation with the disease progression. We set up a standardized reliable protocol to investigate the presence of &#945;Syn aggregates in skin nerve fibers of the PD patient. This protocol involves few short fixation steps, a cryotome sectioning and then a free-floating immunofluorescence double-staining with two specific antibodies: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) to mark the cutaneous nerve fibers and anti 5G4 for detecting &#945;Syn aggregates. It is a versatile, sensitive and easy to perform protocol that can also be applied for targeting other proteins of interest in skin nerves. The ability to mark &#945;Syn aggregates is another step forward to the use of skin biopsy as a tool for establishing a pre-mortem histopathological diagnosis of PD.

Here, we present a protocol for a free-floating indirect immunofluorescence assay on skin biopsy sections that allows for the identification of disease specific conformation variants of alpha synuclein involved in Parkinson disease and multiple proteins of the peripheral nervous system.

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Kutane periphere Nervenfasern durch frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D Kinematische Analyse zur funktionellen Bewertung im Rattenmodell von Ischias-Nerven-Crush-Verletzungen

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. Several recent studies have demonstrated the effectiveness of chronic VNS in enhancing central nervous system plasticity to improve motor rehabilitation, extinction learning, and sensory discrimination. Construction of chronically implantable devices for use in such studies is challenging due to rats&#8217; small size, and typical protocols require extensive training of personnel and time-consuming microfabrication methods. Alternatively, commercially available implantable cuff electrodes can be purchased at a significantly higher cost. In this protocol, we present a simple, low-cost method for construction of small, chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in rats. We validate the short and long-term reliability of our cuff electrodes by demonstrating that VNS in ketamine/xylazine anesthetized rats produces decreases in breathing rate consistent with activation of the Hering-Breuer reflex, both at the time of implantation and up to 10 weeks after device implantation. We further demonstrate the suitability of the cuff electrodes for use in chronic stimulation studies by pairing VNS with skilled lever press performance to induce motor cortical map plasticity.

Existing approaches for constructing chronically implantable peripheral nerve cuff electrodes for use in small rodents often require specialized equipment and/or highly trained personnel. In this protocol we demonstrate a simple, low-cost approach for fabricating chronically implantable cuff electrodes, and demonstrate their effectiveness for vagus nerve stimulation (VNS) in rats.

Vorbereitung von peripheren Nervenstimulationselektroden für die chronische Implantation bei Ratten

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

Automatisierte Gait-Analyse zur Beurteilung der funktionellen Erholung bei Nagetieren mit peripheren Nerven- oder Rückenmarkskontitionsverletzungen

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...