Wir danken Hisayoshi Nozaki (Universität Tokio), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Japan Frauen Universität) und Hiroyuki Sekimoto (Japan Joshi Daigaku). Wir möchten die Kritiken für ihre Beiträge danken. Diese Studie wurde durch eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung (Nr. 26440223 und 15 H 04413) von der Japan Society for Promotion of Science, Japan, und durch einen Zuschuss von der neuen Technologie Development Foundation, Yuki Tsuchikane unterstützt.

1. Erhebung einer Wasserprobe mit Algen
Hinweis: Einzellige Conjugatophytes wachsen in stagnierenden Binnengewässern wie Seen, Sümpfe und Reisfelder. Eine Algen-haltigen Wasserprobe wird von einer dieser Umgebungen, eine Kultur-Sorte zu produzieren gesammelt. Die folgenden Elemente sind erforderlich, bevor der Prozess: net Plankton, einer Einweg-Pipette, und eine Flasche oder ein 50 mL-Tube für das Sammeln von Wasserproben.
<ol><li>Verwenden Sie net in einer See-Umgebung Plankton, um Algen aus dem Wasser zu sammeln. Verwenden Sie eine geeignete Netz, je nach Verwendungszweck. Hinweis: Der obere Teil des Netzes ist durchlässig für Wasser. Die Algen, die durch das Netz gefangen sind in den unteren Behälter zum Plankton net konzentriert. Ein grobes Netz ermöglicht kleine Algen zu durchqueren. Ein feines Netz bekommt leicht verstopft.</li>
	<li>Übertragen Sie das Wasser (ca. 50 mL) auf die 50 mL-Tube oder eine 100 mL PET-Flasche. Bringen Sie die konzentrierte Wasserprobe ins Labor.</li>
	<li>Einzelligen Conjugatophytes wachsen auch in Sümpfen oder Reisfelder. In diesen Bereichen Flachwasser kann Wasserprobe mit Algen mit einer Pipette direkt probieren. Übertragen Sie anschließend das Wasser (30-50 mL) 50 mL-Tube oder einer 50 mL Kunststoff-Flasche. Hinweis: Das Wasser wird sorgfältig über der Bodenoberfläche abgetastet, so dass die Probe keinem Boden enthält.</li>
</ol>2. Bestätigung der Algen
Hinweis: Die folgenden Elemente sind erforderlich: eine Lupe oder portable Mikroskop und eine 60 mm Schale zur Beobachtung.
<ol><li>Um zu bestätigen das Vorhandensein von Algen in der Probe, während es in der Einweg-Pipette ist, verwenden Sie die Lupe die Probe direkt zu beobachten. Hinweis: Größere Zellen von ca. 400-1.000 µm in der Länge (z.B. Closterium Ehrenbergii) können problemlos beobachteten mit dieser Methode.</li>
	<li>Um Algen unter dem portable Mikroskop bestätigen, Gießen Sie die Wasserprobe in einer Petrischale Kunststofflabor.<ol>
<li>Der innere Teil der oberen Hälfte die Probe (ca. 3 mL) aufsetzen (Deckel) der 60 mm Petrischale, dann legen Sie die untere Hälfte mit seinem Unterteil mit Blick auf den inneren Teil des Deckels an der Spitze. Hinweis: Diese Methode verhindert, dass die Probe bewegt und die Beobachtung erleichtert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung der Kapillare Glaspipette aus einer Pasteurpipette für die Isolierung
Hinweis: Bevor Sie beginnen, sind folgende Elemente erforderlich: Pasteur Pipetten, ein Ständer für das Pasteur-Pipetten, Handschuhe, ein Gummiball, ein Geist-Lampe, Methanol für den Geist-Lampe, ein Feuerzeug, Pinzette, einen Mülleimer für Glas, sterilisiert und ein sauberes Zimmer oder blätterig Flow-Haube (falls erforderlich).
<ol><li>Einen Alkohol-Brenner zu zünden.<ol>
<li>Um eine feine Kapillare Glaspipette für die Isolierung zu produzieren, stellen Sie sicher, dass die Flamme nicht flackern ist. Schärfen Sie die Flamme und schmelzen Sie die Pasteurpipette an der Spitze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hitze eine sterile Glas Pasteurpipette auf der Flamme, gestützt auf der Seite der Gummiball von hand und auf der Seite der Spitze mit Pinzette.</li>
	<li>Nehmen Sie Pasteurpipette aus der Flamme und ziehen Sie es.<ol>
<li>Wenn das Glas schmelzen, der Pasteurpipette aus der Flamme schnell zu entfernen und dann ziehen. Hinweis: In diesem Experiment wurde die Pasteurpipette von 15-20 cm. machen sicher erweitert, die die Pipette aus der Flamme während der Zugkraft ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Brechen Sie die Glas-Kapillare-Pipettenspitze auf die richtige Länge. Da die Verbeugung Teil vom feinsten ist, ist es ideal für den Tipp. Hinweis: In dieser Studie wurde eine Kapillare Glaspipette mit einer Spitze von 5-10 cm vorbereitet.<ol>
<li>Achten Sie darauf, die Kapillare nach schmilzt sie entsorgen, und bestätigen, dass die Flamme gelegt wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Luftblasen aus den Kapillaren Glaspipette entlassen geben die Größe der Spitze öffnen. Wählen Sie die richtige Größe für die Zelle isoliert werden. Ca. 1 mm der Bläschen eignet sich für die Isolierung von Closterium Arten, mit Zellenbreite von 10-20 µm.</li>
</ol>4. Single-Cell Isolation durch eine Kapillare Glaspipette
Hinweis: Die folgenden Elemente sind erforderlich, bevor Sie beginnen: ein umgekehrtes Lichtmikroskop, Uhrengläser, einer Plastikschale und steril Gewinde Reagenzgläser, enthält CA Medium (Tabelle 1) oder mittlere CA7konditioniert.
<ol><li>Bereiten Sie ein paar Uhrengläser (22 mm Durchmesser und 1 mm in der Tiefe), jeweils mit 1 mL steriles CA Medium.</li>
	<li>Isolieren einer Zielzelle aus der Wasserprobe im Bereich gesammelt.<ol>
<li>Gießen Sie die Wasserprobe (ca. 30-40 mL) mit den Zielzellen in die Plastikschale.</li>
		<li>Während der Beobachtung die Probe in die Plastikschale unter einem invertierten Lichtmikroskop abholen Einzelzellen mit Kapillare Glaspipette.</li>
		<li>Bringen Sie die Kapillare Glaspipette in der Nähe der Zelle das Streben der Zelle durch Kapillarwirkung zu erleichtern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellen in einem Uhrglas, enthält 1 mL steriles CA Medium (Abbildung 1a).</li>
	<li>Wählen Sie die Zellen wieder mit einer neuen Kapillare Glaspipette aus dem sterilen CA Medium und überträgt es auf ein zweites Uhrglas mit sterilen CA Medium (Abbildung 1 b). Hinweis: Dieser Vorgang wird wiederholt, bis eine einzelne Zelle in der spot Platte (Abbildung 1 c) isoliert ist.</li>
	<li>Die einzelne Zelle mit einem neuen Kapillare Glaspipette abholen, und schließlich in ein Reagenzglas mit 14 mL CA Medium oder konditionierten CA Medium (Abbildung 1 d) übertragen. Inkubation die Probe bei 23 ° C unter einem 16 h Licht: 8-h Dunkel-Zyklus für 2 Wochen. Hinweis: Die unbekannte wird für die Zellproliferation, die abgesondert sind, von der wachsenden Zellen in die Umgebung gehören konditionierten Mittel-und Zellteilung4zu erleichtern. Wenn eine klonale Kultur hergestellt wird, bereiten Sie die konditionierte CA Medium aus dem Kulturmedium4. Die Kultur wird im Erfolgsfall grün.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wickett, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylotranscriptomic+analysis+of+the+origin+and+early+diversification+of+land+plants.">Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).</li><li>Delwiche, C. F., Cooper, E. 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Mit der vorliegenden Methode entstanden 9 klonalen Kultur Stämme von Closterium SP. aus 15 Zellen isoliert von der Wasserprobe (Inba1), vertritt eine 60 % ige Erfolgsquote. Artenkenntnisse wird in Zukunft durch morphologische Beobachtung als auch DNA-Analysen, wie Molekulare phylogenetische Analyse8erfolgen.
In dem vorliegenden Verfahren ist die Frische der Wasserprobe wichtig, die Erfolgsquote. Es ist besser, die Zellen von Wasserproben so bald wie möglich nach der Feldauflistung zu isolieren. Obwohl die Zellen der Gattung Closterium (z. B. C. Ehrenbergii, C. Peracerosum-Strigosum-Littorale Komplex) in der Wasserprobe für ca. 7 d beibehalten werden können, indem es bei 4-8 ° C gespeichert, ist die Isolation der Zellen wünschenswert am Tag der Abholung oder am nächsten Tag. Es ist auch wichtig, sämtliche Verunreinigungen außer den Zielzellen, also die Zahl der Wiederholungen Waschen zu entfernen (d.h., > 3 X) kann eine Kontamination der Kulturen von Mikroorganismen im Boden und Zellen zu verhindern.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass die in diesem Protokoll (CA oder konditionierten CA Medium) verwendeten Nährmedien sind nicht immer geeignet für alle conjugating Algen. In einigen Fällen kann es notwendig zu prüfen, mit einem anderen Medium, sowie anderen Licht und Temperaturbedingungen sein. Auch, da es schwierig zu beweisen, ob eine Kultur von einer einzigen Zelle entwickelt hat, ist es notwendig nur 1 Zelle genau abholen, beim Übertragen von Zellen in einem Reagenzglas. Daher sollte die Übertragung mit einem neuen Kapillare Glaspipette jedes Mal durchgeführt werden.
Zur Gründung einer klonalen Kultur mit dieser Pipette waschen Methode ist eine klassische/Standard-Methode und ist die zuverlässigste Methode zu verwenden, um die gewünschten Zellen für eine Studie zu isolieren. Die klonalen Kulturen der Konjugation Algen verwendet in vielen Studien8,9,10,11 wurden gegründet, mit dem vorliegenden Verfahren. Es ist schwierig, Konjugation Algen ohne einer klonalen Kultur zu analysieren. Darüber hinaus in den letzten Jahren ganze Genomsequenzen de Novo wurde leicht zu beschaffen (z. B.durch die Verwendung des MinION Nanopore Sequencers) und zur Gründung klonaler Kulturen erleichtert weiter de Novo Sequenzierung. Das heißt, ist diese Methode der erste Schritt in die Zukunft studieren dieser Algen, ihre biologische Vielfalt besser zu verstehen.
Um eine stabile Kultur Belastung zu etablieren, ist es notwendig bestimmte kritische Schritte genau innerhalb des Protokolls. Der wichtigste Schritt ist die Vorbereitung der Kapillare Glaspipette mit eine optimale Blende um den Durchgang von nur einer einzigen Zelle zu ermöglichen. Die Öffnung der Kapillare Glaspipette muss etwas mehr als die Länge der Nebenachse der Zelle von Interesse sein. Die optimale Kapillare Glaspipette kann eine einzelne Zelle durch Kapillarwirkung Aspirieren. Wenn der Durchmesser der Öffnung zu groß ist, wird die Kapillare in unbelebter Verunreinigung Materialien oder auch (eine) andere besonders, neben der Zielzelle auch zeichnen.
Um eine Kapillare Glaspipette mit eine optimale Blende zu erhalten, sind folgende Punkte zu beachten. Erstens muss die Säule der Flamme schmal sein, beim Erhitzen von Kapillaren Glaspipette. Als nächstes beim Pasteurpipette ziehen, muss es aus der Flamme entfernt werden; Andernfalls wird die Blende von der Pasteurpipette zusammenbrechen.
Die Ausrüstung und Container gezeigt in diesem Protokoll sind einfach und können geändert werden. Beispielsweise kann mithilfe von Multi-well-Platten anstelle von uhrgläser mit einem Brunnen, der Zelle waschen effizienter gestaltet werden. Darüber hinaus können die Container für andere ähnliche ersetzt werden. Durch eine einzelne Zelle auf dem Kulturmedium im letzten Schritt zu übertragen, kann eine klonale Kultur aufgebaut werden.
Vorbereitung eines sterilisierten Containers und arbeiten in einer Kapuze werden axenic (unbelasteten) Stämme etablieren. Um Verunreinigungen zu vermeiden, ist es notwendig die Waschschritt mit frischen Aliquote mehr als 3 X wiederholen. Manchmal sind Bakterien auch durch Zugabe von Antibiotika15sterilisiert.
Diese Methode konzentriert sich auf Desmid (Zygnematales) isoliert, aber ändern Sie die Größe der Blende Glas Kapillare Pipette, um die Isolation der unterschiedlich großen Plankton angewendet werden.

Konjugation von Algen (des Ordens Zygnematales), besetzen auch bekannt als Conjugatophytes, eine phylogenetische Schlüsselposition als die nächsten lebenden Verwandten der unmittelbaren Vorfahren des Land Pflanzen1,2. Etablierten klonale Kulturen von Algen führten zu einer Vielzahl von taxonomischen, physiologischen und genetischen Studien in den vergangenen Jahren. Die ISOLIERUNGSTECHNIKEN von Mikroorganismen aus einer natürlichen Wiese haben eine lange Tradition-3,-4. In den letzten Jahren etablierte automatisierte Isolierung, die Techniken mit Durchflusszytometrie auch gewesen5. Die am häufigsten verwendete Methode verwendet, um eine einzelne Zelle für die Errichtung einer klonalen Kultur zu erhalten ist die einzellige Isolierung mit einer Glas-Kapillare Pipette-6. Diese traditionelle Methode erfordert Geschick und eine präzise experimentelles Protokoll.
In diesem Artikel zeigen wir die Probenahme von Algen aus Feldproben und die Einrichtung von klonalen Kulturen von einzelligen Algen Konjugation, wie Gattung Closterium mit Hilfe einer Kapillare Glaspipette. Eine Wasserprobe mit vegetativen Zellen wird von der Wiese (z.B., ein See, Teich oder Reisfeld) gesammelt. Die Zellen sind von der Wasserprobe mit Hilfe einer Kapillare Glaspipette isoliert und dann gewaschen. Die Zellen sind in einem Reagenzglas mit Stickstoff ergänzt Medium (CA Medium) kultiviert, bei 24 ° C unter einem 16 h Licht: 8-h dunkel Regime. Diese Methode eignet sich auch zur Isolierung von anderen Mikroalgen zur klonale Kulturen zu generieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sampling</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plankton net</td>
			<td>RIGO, Japan</td>
			<td>N-NO380T</td>
			<td>Mesh size: 32 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE)</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>JAN: 4960759 206725</td>
			<td>Magnification: 20&#215;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier)</td>
			<td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan</td>
			<td>1985-20</td>
			<td>Magnification: 20&#215;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spuit</td>
			<td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan</td>
			<td>Sterile spuit No.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps)</td>
			<td>Labcon, USA</td>
			<td>3181-345-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle (100 mL Polycarbonate bottle)</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>1-7403-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td>
			<td>1010-060</td>
			<td>&#160;For observation of algae.&#160; 60 mm/non-treated dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of a micropipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes (cotton plugged 9&#8221; Pasteur Pipettes)</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>7 &#215; 225 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc)</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>5-5669-01</td>
			<td>10 &#215; 40 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless forceps</td>
			<td>AS ONE Corporation, Japan</td>
			<td>PT-09</td>
			<td>110 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-cell isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Watch glass (Blood reaction board)</td>
			<td>Sekiya Rika Co., Ltd, Japan</td>
			<td>F14-155-030</td>
			<td>to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded test tubes&#160;</td>
			<td>Fujimotorika, Co., Ltd, Japan</td>
			<td>XX142</td>
			<td>18 &#216; &#215; 170 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
			<td>CKX41N</td>
			<td>for isolation of algae.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic dish</td>
			<td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td>
			<td>SH90-15E&#160;</td>
			<td>&#160;90 &#215; 15 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of a clonal culture of unicellular conjugating algae

Es ist unentbehrlich, klonale Kulturen von Mikroalgen für den Einsatz in Studien mit verschiedenen Themen, wie Physiologie, Genetik, Taxonomie und Mikrobiologie. Daher ist es äußerst wichtig, die Entwicklung von Techniken zur klonale Kulturen zu schaffen. In diesem Artikel zeigen wir die Einrichtung einer klonalen Kultur der conjugating Alge. Wasserproben werden aus dem Bereich gesammelt. Anschließend werden Zellen isoliert mit einer Kapillare Glaspipette, in Medien und Bedingungen geeignet zur Erzeugung einer klonalen Kultur angebaut.

Eine Wasserprobe (Inba1) von 50 mL wurden von einer Entnahmestelle in See Inba-Numa (pH 8.1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) im Sakura-Shi, Chiba, Japan, am 25. Juni 2016. Die Wasserprobe wurde bei 4-8 ° c gelagert. Am nächste Tag nach der Sammlung, ein Exemplar von Closterium SP. wurde von der Wasserprobe mit vegetativen Zellen isoliert. Fünfzehn vegetativen Zellen der identische Morphologie (Inba1-1,-2-3-4,-5,-6, -7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14, und-15) wurden isoliert von der Probe und dann mit der Pipette waschen Methode gewaschen. Fünfzehn isolierte Einzelzellen wurden in unabhängigen Reagenzgläser mit 15 mL konditionierten CA Medium kultiviert. Nach 2 Wochen Inkubation, Zellproliferation wurde in 9 Reagenzgläsern beobachtet [Inba1-1, -3,-4-5 (Abbildung 2a),-6,-9,-10,-12 (Abb. 2 b) und-13; Tabelle 2]. Neun klonale Kulturen entstanden aus der Inba1 Probe Isolate (Abbildung 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg"> Abbildung 1 : Der Fluss der einzelligen Isolation. (ein) Übertragung der einzelnen Zielzelle Algen aus der ursprünglichen Wasserprobe auf der sterilen Medium in das erste Uhrglas. (b, c) Übertragen der Zelle wieder auf das nächste Uhrglas zu waschen. Dieses Verfahren sollte wiederholt werden, bis es keine anderen Zellen/Verunreinigungen als das Ziel in der Mitte gibt; drei Uhrengläser sind im Diagramm hier exemplarisch dargestellt. (d) schließlich übertragen die gewaschene Zelle in einem Teströhrchen das geeignete Medium für Wachstum. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg"> Abbildung 2 : Fotos von vegetativen Zellen des Closterium SP. (ein) Inba1-5) und (b) Inba1-12 werden hier gezeigt. Die Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg"> Abbildung 3 : Einrichtung einer klonalen Kultur aus der Probe Inba1. Die Reagenzgläser für 2 Wochen kultiviert wurden von unten fotografiert. Ein Sternchen gibt Zellproliferation. Die Maßstabsleiste = 2 cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Name des Mediums</td>
			<td>Referenz</td>
			<td colspan="2">Kommentare</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">CA</td>
			<td rowspan="13">Bakumatsu und Watanabe12
</td>
			<td>Ca (NO3)2·4H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>KNO3
</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Nr.3
</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β-Na2glycerophosphate·5H2O</td>
			<td>3 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vitamin B12</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotin</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thiamin-HCl</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>PIV-Metalle</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe (als EDTA; 1:1 Molar)</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Fügen Sie Wasser auf 100 mL zu machen</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">pH mit NaOH auf 7,2 einstellen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">P IV Metalle</td>
			<td rowspan="7">Provasoli und Pintner13
</td>
			<td>Na2EDTA·2H2O</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl3·6H2O</td>
			<td>19,6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2· 4H2O</td>
			<td>3,6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2*</td>
			<td>1,04 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>0,4 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2MoO4·2H2O</td>
			<td>0,25 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Fügen Sie Wasser auf 100 mL zu machen</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fe (als EDTA; 1:1 Molar)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14
</td>
			<td>Fe (NH4)2(also4)2·6H2O,</td>
			<td>70,2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA·2H2O,</td>
			<td>66 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Fügen Sie Wasser auf 100 mL zu machen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Konditionierte CA medium</td>
			<td>Abe Et Al.7
</td>
			<td colspan="2">14 – 20 Tage inkubieren Sie Zellen in frischen CA Medium. Sammeln der kultivierten Mediums durch Filtration mit qualitativen Filterpapier und Sterilisieren Sie die gefilterten Medium durch Autoklavieren (121 ° C für 15 min).</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* In den NIES ist 2,2 mg ZnSO4·7H2O. 1,04 mg ZnCl2 abgelöst.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Formulierungen der in dieser Studie verwendeten Medien.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Wasserprobe</td>
			<td>Name der Zelle</td>
			<td>Status nach Kultur</td>
			<td>Stamm-name</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>Inba1-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>-2</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-3</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>-4</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>-5</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>-6</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>-7</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-8</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-9</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-9</td>
		</tr>
<tr>
<td>-10</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>-11</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-12</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-12</td>
		</tr>
<tr>
<td>-13</td>
			<td>Zellen vermehren</td>
			<td>inba1-13</td>
		</tr>
<tr>
<td>-14</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-15</td>
			<td>Nicht geändert</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Die Isolierung Studie Zusammenfassung.

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Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Algen Konjugation

In diesem Artikel zeigen wir die Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Konjugation Algenarten aus einer natürlichen Wiese gesammelt.

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

establishment-of-a-clonal-culture-of-unicellular-conjugating-algae

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Aufrufe.  Japan Women's University. In diesem Artikel zeigen wir die Einrichtung einer klonalen Kultur der einzelligen Konjugation Algenarten aus einer natürlichen Wiese gesammelt.

Serie: Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Forschung

Biologie

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Isolierung von CD133 + Leber-Stammzellen für die klonale Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale expansion, may become cumbersome, laborious and time-consuming when large numbers of cells are required. To address this need, the performance of a new multi-layered cell culture vessel to facilitate easy scale up of cells from single layered T-flasks will be discussed. The flasks tested are available in 3- and 5-layer format and enable culture and complete recovery of three and five times the number of cells respectively, compared to T-175 flasks. A key feature of the BD Multi-Flask is a mix/equilibration port that allows rapid in-vessel mixing as well as uniform distribution of cells and reagents within and 
between layers of each vessel and consistently produce cells that can be cultured in an environment that is congruent to T-175 flasks.
The design of these Multi-Flasks also allows for convenient pipette access for adding reagents and cells directly into the flasks as well as efficient recovery of valuable cells and reagents and reduces risk of contamination due to pouring. For applications where pouring is preferred over pipetting, the design allows for minimal residual liquid retention so as to reduce wastage of valuable cells and reagents.

Cells play an instrumental and increasing role in research, and the discovery and development of new therapeutics. With this increasing need for greater number of cells we need more efficient and effective ways for growing and harvesting attachment dependent cells. A Multilayered flask with the right features can serve this purpose.

Scale-Up von Mammalian Cell Culture mit einem New Mehrschichtige Flask

A growing number of cell-based applications require large numbers of cells. Usage of single layer T-flasks, that are adequate during small-scale ...

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a chemically stratified water column and unlike other inland bodies of water, largely prevents external input of carbon and nutrients from streams. Biota are exposed to numerous environmental stresses, including year-round severe nutrient deficiency, low temperatures, extreme shade, hypersalinity, and 24-hour darkness during the winter 1. These extreme environmental conditions limit the biota in Lake Bonney almost exclusively to microorganisms 2.
Single-celled microbial eukaryotes (called "protists") are important players in global biogeochemical cycling 3 and play important ecological roles in the cycling of carbon in the dry valley lakes, occupying both primary and tertiary roles in the aquatic food web. In the dry valley aquatic food web, protists that fix inorganic carbon (autotrophy) are the major producers of organic carbon for organotrophic organisms 4, 2. Phagotrophic or heterotrophic protists capable of ingesting bacteria and smaller protists act as the top predators in the food web 5. Last, an unknown proportion of the protist population is capable of combined mixotrophic metabolism 6, 7. Mixotrophy in protists involves the ability to combine photosynthetic capability with phagotrophic ingestion of prey microorganisms. This form of mixotrophy differs from mixotrophic metabolism in bacterial species, which generally involves uptake dissolved carbon molecules. There are currently very few protist isolates from permanently ice-capped polar lakes, and studies of protist diversity and ecology in this extreme environment have been limited 8, 4, 9, 10, 5. A better understanding of protist metabolic versatility in the simple dry valley lake food web will aid in the development of models for the role of protists in the global carbon cycle.
We employed an enrichment culture approach to isolate potentially phototrophic and mixotrophic protists from Lake Bonney. Sampling depths in the water column were chosen based on the location of primary production maxima and protist phylogenetic diversity 4, 11, as well as variability in major abiotic factors affecting protist trophic modes: shallow sampling depths are limited for major nutrients, while deeper sampling depths are limited by light availability. In addition, lake water samples were supplemented with multiple types of growth media to promote the growth of a variety of phototrophic organisms.
RubisCO catalyzes the rate limiting step in the Calvin Benson Bassham (CBB) cycle, the major pathway by which autotrophic organisms fix inorganic carbon and provide organic carbon for higher trophic levels in aquatic and terrestrial food webs 12. In this study, we applied a radioisotope assay modified for filtered samples 13 to monitor maximum carboxylase activity as a proxy for carbon fixation potential and metabolic versatility in the Lake Bonney enrichment cultures.

Microbial eukaryotes are both a source of photosynthetically-derived carbon and top predatory species in permanently ice-covered Antarctic lakes. This report describes an enrichment culture approach to isolate metabolically versatile microbial eukaryotes from the Antarctic lake, Lake Bonney, and assesses inorganic carbon fixation potential using a radioisotope assay for Ribulose-1,5-bisphophate carboxylase oxygenase (RubisCO) activity.

Establishment of Microbial Eukaryotische Anreicherungskulturen aus einer chemisch geschichteten antarktischen See und Bewertung der Kohlenstoff-Fixierung Potential

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental biologist. For many organs it is difficult to access developing tissue to allow monitoring during ex vivo culture. The slice culture method allows access to tissue so that morphogenetic movements can be followed and specific cell populations can be targeted for manipulation or lineage tracing.
In this paper we describe a method of slice culture that has been very successful for culture of tooth germs in a range of species. The method provides excellent access to the tooth germs, which develop at a similar rate to that observed in vivo, surrounded by the other jaw tissues. This allows tissue interactions between the tooth and surrounding tissue to be monitored. Although this paper concentrates on tooth germs, the same protocol can be applied to follow development of a number of other organs, such as salivary glands, Meckel&#39;s cartilage, nasal glands, tongue, and ear.

Here we detail a method to culture tooth germs in mandible slices using a tissue chopper. This method allows unique access to the tooth during development, providing excellent opportunity for manipulation and lineage tracing, not available using more traditional culture methods.

Die Slice-Kultur-Verfahren zur Nach Entwicklung der Zahnkeime In Explantation Kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls and carotenoids. In vivo, these proteins are folded with pigments to form complexes which are inserted in the thylakoid membrane of the chloroplast. The high similarity in the chemical and physical properties of the members of the family, together with the fact that they can easily lose pigments during isolation, makes their purification in a native state challenging. An alternative approach to obtain homogeneous preparations of LHCs was developed by Plumley and Schmidt in 19871, who showed that it was possible to reconstitute these complexes in vitro starting from purified pigments and unfolded apoproteins, resulting in complexes with properties very similar to that of native complexes. This opened the way to the use of bacterial expressed recombinant proteins for in vitro reconstitution. The reconstitution method is powerful for various reasons: (1) pure preparations of individual complexes can be obtained, (2) pigment composition can be controlled to assess their contribution to structure and function, (3) recombinant proteins can be mutated to study the functional role of the individual residues (e.g., pigment binding sites) or protein domain (e.g., protein-protein interaction, folding). This method has been optimized in several laboratories and applied to most of the light-harvesting complexes. The protocol described here details the method of reconstituting light-harvesting complexes in vitro currently used in our laboratory, and examples describing applications of the method are provided.

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.

In-vitro-Rekonstitution der Lichtsammelkomplexe der Pflanzen und Grünalgen

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Errichtung einer extrazellulären sauren pH-Wert Kultursystem

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Etablierung und Pflege von Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

Gewebekultur der Rinderovariarinde

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the executor for most of the liver functions, primary hepatocytes have limited proliferating capacity. This requires the establishment of ex vivo hepatocyte expansion models for liver physiological and pathological research. Here, we isolated murine hepatocytes by two steps of collagenase perfusion and established a 3D organoid culture as the 'mini-liver' to recapitulate cell-cell interactions and physical functions. The organoids consist of heterogeneous cell populations including progenitors and mature hepatocytes. We introduce the process in detailed to isolate and culture the murine hepatocytes or fetal hepatocyte to form organoids within 2-3 weeks and show how to passage them by mechanically pipetting up and down. In addition, we will also introduce how to digest the organoids into single cells for lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering. The organoids can be used for drug screens, disease modelling, and basic liver research by modeling liver biology and pathobiology.

A long-term ex vitro 3D organoid culture system was established from mouse hepatocytes. These organoids can be passaged and genetically manipulated by lentivirus infection of shRNA/ectopic construction, siRNA transfection and CRISPR-Cas9 engineering.