Diese Arbeit wird von der Krembil Stiftung (Betriebskostenzuschuss CMM) finanziert. WX erhielt der Carlton Marguerite Smith Student Award. NL erhielt eine Ontario-Graduate-Stipendium.

Dieses Protokoll wurde genehmigt, die vom Tier Pflege an der University of Toronto und steht im Einklang mit "Guide, der Pflege und Verwendung der Versuchstiere" (2Nd Edition, Canadian Council on Animal Care, 2017).
1. minimale Spinal Cord Injury Chirurgie
Hinweis: Vor der Operation stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente und Materialien durch geeignete Methoden (Abbildung 1A) sterilisiert werden.
<ol><li>Bauen Sie einen thorakalen Bogen von 4 – 5 Plätze der Gaze aufrollen und Tapen sie zusammen in der Mitte eine feste Rolle von Gaze zu erhalten.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in der Induktion Kammer und initiieren Sie Anästhesie mit 5 % Isofluran zu. Das Fehlen einer Zehe Prise Reflex, bevor Sie fortfahren, als auch während des Verfahrens zu bestätigen. Während die Operation mehr als 30 min dauern kann, optimieren Sie für die minimale Isofluran-Belichtung (5 min. 5 %) und die verbleibende Zeit bei 2 – 3 %.</li>
	<li>Übertragen Sie die Maus auf eine Nase Kegel an der Narkose Maschine bei 2 – 3 % Isofluran Erhaltungsdosis befestigt. Verwenden Sie Haarschneidemaschinen, um Pelz aus der Rücken des Tieres aus der Mitte des Rückens bis zu den Hals/Ohren zu entlarven einen breiten rechteckigen Bereich der Haut für eine Operation zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Maus auf ein stereotaxischen Instrument, indem man seine Nase in die beigefügte bugnase und Stabilisierung des Schädels mit Ohr-Bars. Isofluran bei 5 % während der Platzierung der Ohr-Bars und unteren wieder auf 2 – 3 % zu erhalten, sobald die Maus in der stereotaktischen Gerät gesichert ist.</li>
	<li>Präoperative schmerzstillende Medikamente intraperitoneal verwalten – Meloxicam (2,0 mg/kg). Wenden Sie großzügig Auge Schmierung auf die offene Maus Augen Hornhaut Austrocknung bei der Narkose zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie die thorakalen Bogen unterhalb der Maus Bauch während Begradigung der Maus Körper und Wirbelsäule durch leichtes Ziehen an der Schwanzwurzel. Verwenden Sie Labor Kennzeichnung Band um die Rute und alle erweiterten Gliedmaßen in einer sternförmigen Position zu sichern. Sobald sicher ist, drücken Sie die thorakalen Bogen Rostral, aus dem Bauch der Maus in Richtung der oberen Brustkorb – um die Brustwirbelsäule (Abbildung 1 b) zu stützen.</li>
	<li>Bereiten Sie ein steriles Operationsfeld durch Desinfektion das Fell abgeschnitten Hautareal in Schritt 1.3 mit 70 % Ethanol, gefolgt von Povidon-Jod vorbereitet. Zweimal wiederholen. Wenden Sie ein steriles op Tuch um einen breiten sterilen Bereich zu halten.</li>
	<li>Mit einem #10 Skalpellklinge, machen Sie einen vertikalen Schnitt parallel zur Längsachse des Tieres vom Mittelpunkt der beiden Schulterblättern an die Krümmung der Brustwirbelsäule. Ziehen Sie die Haut, Weichteile und die Kontur der Wirbelsäule (Abbildung 1) aussetzen.</li>
	<li>Identifizieren Sie den unteren Rand des suprascapular Fettpolster (dies abgrenzt die T4/5 Ebene der Wirbelsäule). Schneiden Sie mit der gleichen #10 Klinge vorsichtig aber mit Kraft, entlang beider Seiten des vertebralen Knochen T5-T8/9, die Rücken-Muskel-Sehnen aus der Spalte zu lösen.</li>
	<li>Legen Sie die Zähne der Retraktoren in Schnitt Standorte auf beiden Seiten der Wirbelsäule. Passen Sie die Belichtung mit dem Ausbau der Retraktoren um die Wirbelsäule ausreichend zu erhöhen, ohne zu viel belasten die eingefahrenen Muskelschichten (Abbildung 1).</li>
	<li>Unter dem Operationsmikroskop sorgfältig reinigen der restlichen Muskel und andere Weichteile über der Wirbelsäule um den vertebralen Knochen (Abb. 1E) verfügbar zu machen. Identifizieren Sie die Wirbel, die werden durch umklammern den Dornfortsatz der Wirbel mit gezahnten Zangen und bewegte sie leicht entfernt werden und nach unten. Hinweis: Dies sollte Identifizierung der intervertebralen Gelenke ermöglichen und die kleinen Öffnungen (Foramina Bandscheiben) unter den Wirbeln von Interesse.</li>
	<li>Legen Sie einen Kopf der abgestumpften gebogene Schere in beiderseits der exponierten Bandscheiben Foramen, kaudalen, der Wirbelkörper Lamina, herausgeschnitten werden und schneiden Sie die Bandscheiben Anschlussfugen bilateral.</li>
	<li>Heben Sie der Lamina nach oben und schneiden Sie die obere Befestigung der Lamina zu isolieren und entfernen die Knochen. Hinweis: Dadurch werden die intakte duralsack, enthält das Rückenmark (Abb. 1F) sichtbar. Möglicherweise gibt es übermäßige Blutungen, die gesteuert werden kann, indem man vorgeschnitten 1 x 1 cm Gaze auf die betroffenen Gebiete und/oder mit sterilen PBS waschen.</li>
	<li>Legen Sie mit der dorsalen Mittellinie Vene als ein Wahrzeichen eine 45° gebogene Welle von einer Nadelspitze 30 G (mit Nadel Fase nach oben) in der dorsolateralen Oberfläche des Rückenmarks (ca. 1 mm tief) bei etwa 0,5 mm seitlich auf beiden Seiten der Mittellinie.</li>
	<li>Bewegen Sie die Nadel ~ 2 mm von kaudalen, rostral (Parallel zu der Mittellinie) so dass die gesamte Länge der Abschrägung der Nadel in die Schnur eingelegt wird. Entfernen Sie die Nadel durch Rückverfolgung über den Pfad des Eintrags (Abbildung 1). Hinweis: Es dürfen keine Blutung aber Schwellung des spinalen Gewebes kann bei diesem Schritt gesehen werden.</li>
	<li>Um die Wunde zu schließen, entfernen Sie die Aufrollvorrichtung und die Rückenmuskulatur auf beiden Seiten der Verletzung zusammen in der Mittellinie mit einer 6-0 resorbierbaren Naht zu Naht. Verwenden Sie eine 4-0 sterile Seide Naht, um anschließend die darüber liegende Haut zu schließen.</li>
	<li>Auftragen Sie antibiotische Salbe an die Spitze der oberflächlichen genähten Haut zur Vorbeugung von postoperativen Infektionen mit der Spitze von einem Wattestäbchen Postoperative Schmerzmittel von 0,1 mg/kg von Buprenorphin subkutan zusammen mit Flüssigkeiten (1 mL gesäugt Ringer Lösung) zu verwalten.</li>
	<li>Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane und Sauerstoff. Entfernen Sie die Maus aus der stereotaktischen Gerät und in einen sauberen Käfig mit keine Bettwäsche.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in den Käfig ca. 30 cm entfernt von einer Wärmelampe für die Wiederherstellung von Anästhesie und Monitor Verhalten nach dem Aufwachen. Die Maus sollte innerhalb von 5 – 10 min. aufwachen und haben die Hirschkuh-Limb-Funktion mit möglichen Parese und/oder Schweif Schwäche nach dem Aufwachen.</li>
	<li>Verhalten der Maus in den nächsten Tagen zu überwachen und postoperative Pflege und Analgetika (d.h., Maische, gesäugt Ringer Lösung Flüssigkeit subkutan, 0,1 mg/kg Buprenorphin 2 x täglich subkutan für 2 – 3 Tage und Eigengewicht Überwachung ) gemäß lokalen Tierhaus Vorschriften und im Einzelfall als Verwertung kann variieren.</li>
</ol>2. Neurosphäre Assay Dissektion
Hinweis: Führen Sie korrekte sterile Gewebekultur Verfahren in der gesamten.
<ol><li>Vorbereitung der enzymatischen Lösung
	<ol>
<li>Am Albumin Ovomucoid Inhibitor mit Glasflasche und sanft Wirbel bis aufgelöst fügen Sie 32 mL von Earle es ausgewogen Salz Lösung (EBSS hinzu).</li>
		<li>Ein vorportionierte Papain glasphiole 5 mL EBSS hinzu, und legen Sie in einem 37 ° C Wasserbad auflösen. Die Lösung wird klar (Lösung 1).</li>
		<li>Nehmen Sie 500 µL EBSS und fügen Sie die vorportionierte DNase ich Glas-Fläschchen zu einer Konzentration von 1 mg/mL (Lösung 2). Lösung 1 fügen Sie 250 µL dieser Mischung hinzu und mischen Sie sehr leicht durch das Fläschchen hin und her kippen. Hinweis: Alle Lösungen gemacht (Lösung 1 und 2) sind genug für die Verarbeitung von zwei Stücken des Gewebes. Wenn mehrere Stücke von Gewebe verarbeitet, mit mehr Lösung Prep unterzubringen.</li>
	</ol></li>
	<li>Gewebe-Vorbereitung und Dissektion
	<ol>
<li>Ort ein Labor abwischen Isofluran in den Käfig Maus trieft und lassen 2-3 min für Dämpfe um Maus komplett zu betäuben. Folgenden ko, entfernen Sie die Maus aus dem Käfig und das Fehlen einer Zehe-Prise Reflex zu bestätigen.</li>
		<li>Führen Sie durch zervikale Dislokation mit einem stumpfen Metallgegenstand (d.h., Metall-Käfig-Karte), das Tier einzuschläfern. Sprühen Sie das euthanasierten Tier aus seinem Hals zu Mitte hinten großzügig mit 70 % Ethanol.</li>
		<li>An der Basis des Schädels mit einer Schere den Kopf abschneiden und in einen Bio-Beutel entsorgen. Machen Sie einen Mittellinie Schnitt in der Haut über die gesamte Länge des Rückens, die Muskeln und Wirbelsäule Knochen Kontur (Abbildung 2A) verfügbar zu machen.</li>
		<li>Heben Sie die medialen Aspekt jedes Schulterblatt (dh., Schulterblatt – durch darüberliegende fettlappen identifiziert) und mit einer Schere wegschneiden Weichgewebe (zwischen Schulterblatt und Wirbelsäule). Separate voll, die zugrunde liegenden vertebrale Spalte verfügbar zu machen.</li>
		<li>Im Anschluss an die Krümmung der Wirbelsäule stecken Sie das gleiche Paar der Schere in die oberen thorakalen Blende und isolieren Sie der Wirbelsäule durch Wegschneiden beigefügten Rippen, Muskeln und inneren Organen (Abb. 2 b) zu.</li>
		<li>Einführen Sie Schere in die Caudale Wirbelkörper Foramen/Öffnung und schneiden Sie die intervertebralen Gelenke auf beiden Seiten der Schichten (dorsalen Oberfläche). Achten Sie besonders darauf, das intakte Kabel nicht beschädigen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gewünschte Niveau und/oder Länge des Kabels ist ausgesetzt.</li>
		<li>Schneiden Sie vorsichtig die Spinal nerve(s) seitlich erstreckt sich von der Schnur vor das Rückenmark Gewebe in einer Petrischale mit regelmäßigen künstliche Liquor cerebrospinalis übertragen. Halten Sie die Probe auf Eis (Abbildung 2).</li>
		<li>Schneiden Sie unter dem Mikroskop Dissektion das Rückenmark Gewebe um ~ 2 mm rostral und kaudalen, Verletzung Aufstellungsort erweitert. Zwei Paare der Zange verwenden, um das Kabel vorsichtig in 2 Hälften längs entlang der dorsalen und ventralen Risse zu trennen (Abbildung 2").</li>
		<li>Schneiden Sie mit Microscissors den verletzten dorsolateralen weißen Substanz. Legen Sie das Stück in ein 15 mL konische Röhrchen.</li>
		<li>Hält man die Hälfte des Rückenmarks nach unten mit der Pinzette, necken und Entfernen der weißen Substanz mit ein weiteres Paar feine Pinzette entlang der Rostrocaudal Umfang des Rückenmarks, um die gewünschten periventrikulären Region zu isolieren. Wiederholen Sie für die andere Hälfte des Rückenmarks.</li>
		<li>Legen Sie die Stücke von periventrikulären Gewebe in einer separaten 15 mL konische Röhrchen. Verwenden Sie Microscissors und sanft das Gewebe gegen die Wände der konischen Röhren Blatt vor den Mund. Hinweis: Gewebe Dissoziation Modifikationen stammen aus Papain Dissoziation Systemprotokoll23 und zuvor beschriebenen Gewebe Vorbereitung Verfahren24.</li>
		<li>Die Gewebeprobe 2,5 mL des neuen Lösung 1 (Schritt 2.1.3) hinzu, und legen Sie auf einer Wippe bei 37 ° C für 30 Minuten.</li>
		<li>Genannte sanft das Gewebe in der Lösung mit einer PIPETTENSPITZE 1.000 µL. Zentrifugieren Sie die trüben Zellsuspension bei 300 X g für 5 min bei RT</li>
		<li>Bereite Lösung 3 mit 2,7 mL Earle es ausgewogen Salzlösung, 300 µL Ovomucoid Inhibitor Lösung (Schritt 2.1.1) und 150 µL der DNase ich Lösung (Schritt 2.1.3).</li>
		<li>Den überstand von Schritt (Schritt 2.2.13) zu verwerfen und Aufschwemmen in 1,5 mL der Lösung 3 aus dem vorherigen Schritt (Schritt 2.2.14).</li>
		<li>Diese neue Zellsuspension (Schritt 2.2.15) auf 5 mL Ovoimucoid Inhibitor Lösung (Schritt 2.1.1) in einem neuen 15 mL konische Rohr erstelle ich einen diskontinuierlichen Dichtegradienten Schicht. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei RT.</li>
		<li>Überstand verwerfen und erneut in 2 mL Neurobasal Medien. Zentrifuge bei 300 X g für 3 min bei RT.</li>
		<li>Überstand verwerfen und in 1 mL Neurobasal Medien aufzuwirbeln. Filtern Sie die Suspension mit einer 20 µm Zelle Sieb gefolgt von 4 mL der Medien für ein Gesamtvolumen von 5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Beschichtung
	<ol>
<li>Neurosphäre Wachstum durch die Ergänzung Neurobasal Medien mit epidermalen Wachstumsfaktor (20 ng/mL) Nährmedien vorbereiten / Fibroblasten Wachstum Faktor (20 ng/mL) / Heparin (2 µg/mL) [für definitive NSCs] oder Leukemina hemmenden Faktor (10 ng/mL) [für primitive NSCs]. Fügen Sie 10 mL der beiden Medien in einer Gewebekultur Flasche 25 mL.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Hemocytometer und Trypan blau färben, berechnen Sie die Anzahl der Zellen in Suspension aus (Schritt 2.2.18)25. Sobald berechnet, Zellen hinzufügen Gewebe Kulturflaschen vorbereitet (Schritt 2.3.1) zu einer klonalen Dichte von 10 Zellen/µL und Ort Gewebekultur-Kolben mit zusätzlichen Zellen in den Brutkasten für 24 h (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2). Hinweis: Ein Beispiel für die Zählung Technik lautet wie folgt: nehmen Sie 10 µL Zellsuspension und Mix mit 10 µL Trypan blau färben. Fügen Sie 10 µL dieser Mischung in eine Hemocytometer. Unter einem 10-fach Lichtmikroskop zählen die Anzahl der lebenden Zellen und die Summe aller Zellen innerhalb 4 der 4 x 4-Quadranten gezählt. Verwenden Sie die Formel: 100.000/[(X cells/4) x 2 x 10 x 1.000], geben Sie das Volumen der Zellsuspension auf in jedem 25 mL Gewebekultur Kolben darauf klonalen Dichte (10 Zellen/µL) überzogen werden.</li>
		<li>Nach 24 h sanft schwenken Sie die Flasche und Inhalt in eine 15 mL konische Rohr. Zentrifuge bei 300 X g für 5 min bei RT.</li>
		<li>Den überstand verwerfen und erneut aussetzen der Zellen in 1 – 2 mL frische Neurobasal Medien.</li>
		<li>Wiederholen Sie Schritt 2.3.2 um die Anzahl der Zellen in Suspension und Platte Zellen zur klonalen Dichte in einer Gewebekultur 24-Well-Platte mit 500 µL ihrer jeweiligen Mitogen ergänzt Medien (EFH für definitive NSC Wachstum) und LIF für primitive NSC Wachstum. Hinweis: Verwenden Sie die angepasste Formel (5.000 / [X Zellen/4) x 2 x 10 x 1.000), berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension auf in jeweils gut 500 µL Medien überzogen werden.</li>
		<li>Platten mit Zellen in den Inkubator (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 95 %, 5 % CO2) wachsen für 7 Tage zu platzieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Zählen
	<ol>
<li>Nach 7 Tagen in der Kultur Platten ausbauen und unter einem Lichtmikroskop anzeigen. Neurosphären durch zählen kugelige Kolonien, die zu quantifizieren > 80 µm im Durchmesser für dNSCs Kulturen und > 50 µm Durchmesser für pNSCs Kulturen. Hinweis: Bei Bedarf neurosphären können weitere passagiert26 oder differenziert. Wenn Zellen nicht mehr benötigt werden, indem Sie Brunnen (ca. 1 mL) für 20 min beschleunigte Wasserstoffperoxid hinzufügen, so dass die Farbe des Mediums gelb zu entsorgen. Dann verwerfen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Johansson, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+neural+stem+cell+in+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Identification of a neural stem cell in the adult mammalian central nervous system.</a> Cell. 96 (1), 25-34 (1999).</li><li>McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+the+central+nervous+system.">Stem cells in the central nervous system.</a> Science. 276 (5309), 66-71 (1997).</li><li>Gage, F. 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A., Merkler, D., Dietz, V., Schwab, M. E., Fouad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+testing+of+motor+function+in+spinal+cord+injured+rats.">Efficient testing of motor function in spinal cord injured rats.</a> Brain Research. 883 (2), 165-177 (2000).</li><li>Hamers, F. P., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CatWalk-assisted+gait+analysis+in+the+assessment+of+spinal+cord+injury.">CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während des chirurgischen Eingriffs gibt es ein paar wichtige Schritte wo die Forscher besondere Aufmerksamkeit widmen sollte, um optimale Ergebnisse zu erhalten und zu minimieren Variabilität zwischen den Tieren. Mit der eingeatmeten Anästhesie (Isofluran) während der Operation achten wie die Narkose neuroprotektive Wirkung mit längerer Exposition27gezeigt hat. Entsprechend, wenn das Studium der Regenerationsfähigkeit des Rückenmarks nach Verletzung, bemühen Sie, so schnell und effizient wie möglich zu verhindern, dass konfundierenden Variablen operieren. Beibehaltung der gleichen Isofluran Belichtungszeit per Mausklick reduziert Variabilität. Die Atemfrequenz der Maus sollten während der Operation überwacht werden und sollte nicht zu langsam (weniger als 1 Atem alle 2 – 3 s) oder stark erschwerte (d.h., nach Luft schnappen). Die Erhaltungsdosis von Anästhesie kann von 2 – 3 % gesenkt werden, Tod aufgrund längerer Betäubung mit der Note von Mäusen zu verhindern, die die niedrigere Dosierung erhalten.
Während der Operation seien Sie besonders vorsichtig beim muskulösen Einschnitte auf beiden Seiten der Wirbelsäule durchführen. Stellen Sie sicher, dass die Kürzungen tief sind, und die Klinge medial abgewinkelt ist, so dass die Schneide des Messers gegen den knöchernen Wirbeln während muskuläre Schnitt liegt. Wenn die Klinge nach außen abgewinkelt ist, gibt es die Möglichkeit des übermäßigen Blutungen von vaskulären schneidet. Die Forscher sollten auch zusätzliche achten bei der Durchführung der Laminektomie um Tiefe Angeln der Schere zu vermeiden, die das Rückenmark beschädigt wird verursacht unerwünschte Gewebeschäden und funktionelle Defizite. Das entsprechende Steuerelement für diese Experimente ist eine "nur Laminektomie" Gruppe (keine Verletzungen), ermöglicht einen Vergleich der Aktivierung von NSCs die Nadel Track Verletzung im Gegensatz zur Laminektomie nur daraus kann zugeschrieben. Wir haben gezeigt, dass Laminektomie allein in eine kleine, wenn auch unbedeutende Erhöhung NSC Aktivierung führen kann, wie durch eine Zunahme der neurosphäre Zahlen aus der periventrikulären Region auf der Ebene der Läsion21offenbart. Laminektomie allein verursacht keine Erhöhungen in neurosphäre Zahlen aus der periventrikulären Region rostral oder kaudalen, die Laminektomie und keine neurosphären finden sich in den Kulturen der weißen Substanz isoliert auf der Ebene der Laminektomie. Darüber hinaus bei der Durchführung der Laminektomie kümmern Sie, um der dorsalen Lamina in einem Stück erlauben große Exposition der Schnur zu entfernen. Dies wird (1) ausreichend Zugriff auf minimale Nadel Track Verletzungen des Rückenmarks dorsolateralen durchzuführen und (2) verhindern, dass Teile der Knochen zurückgelassen und sekundären Schäden nach Schließung und nach der Wiederherstellung-Bewegung der Maus. Wenn der gesamte Lamina nicht als Einteiler gilt oder Segmente der überstehenden scharfen Knochen auf beiden Seiten der Laminektomie beobachtet, verwenden Sie Instrumente (z. B. gezahnten Zangen und gebogene Schere) um diese Fragmente vor dem Nähen zu entfernen.
Die Forscher sollten extrem vorsichtig bei der Anwendung von Fäden auf die Muskelschicht während der operativen Verschluss sein. Eine Naht (Doppel-geknotet) sollte auf das Niveau der Laminektomie/Verletzung kaudalen platziert werden, damit die Naht auf der Oberseite der intakten vertebralen Knochen liegt. Dies soll Folgeschäden zu verhindern, die von der muskulösen Naht, in Kontakt mit das freiliegende Kabel, wenn die Maus, nach der Wiederherstellung bewegt führen kann. Darüber hinaus fungiert die muskuläre Naht, die Laminektomie/Verletzung kaudalen als ein Wahrzeichen für wo die SCI durchgeführt wurde, wenn das Rückenmark zur Analyse zu isolieren. Vorsicht bei den verletzten Rückenmark Bereich sezieren zu vermeiden, die Struktur der verletzten Region beeinträchtigen, so dass es während der feinen Dissektion unter dem sezierenden Mikroskop erkennbar bleiben kann. In Bezug auf die neurosphäre Test ist es wichtig, führen Sie die mechanische Zerreibung der Zelle Pellets sanft auf die Produktion von Luftblasen zu vermeiden, die Zelltod erhöhen können. pNSC abgeleitet neurosphären sind auch anfälliger für Schmutz schwer, Wachstumsbedingungen – übermäßige Verreibung und über längere Zeit in enzymatische Lösungen – im Vergleich zu dNSC Kulturen. pNSC abgeleitet Sphären sind kompakter und kleiner als dNSCs. Angesichts der Seltenheit des pNSCs, empfehlen wir mindestens 240.000 Zellen pro Probe zu isolieren.
Das minimale SCI-Modell ist ideal für das Studium der zelluläre Ereignisse nach Verletzungen (z. B. die Aktivierung des endogenen NSCs), aber es nicht zulässt, dass die Untersuchung der funktionellen Beeinträchtigungen. Wie bereits erwähnt, Mäuse, die von der Nadel Weg Verletzung erholen erleben keine bemerkenswerte Verhaltensstörungen Defizite, die beibehalten und als solche nicht die Mäuse für die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen zur Verbesserung der funktionellen Ergebnisse ausgewertet werden. Ein wichtiger Aspekt der regenerativen Medizin ist, dass eine Behandlung nicht nur Reparatur von Gewebe fördern sollen (welche ausgewertet werden können, mit diesem Modell in Kombination mit der neurosphäre Assay, Linie Tracing und Immunohistochemistry/Immunfluoreszenz) aber relevante Funktionsverbesserung mit Verhaltensstörungen Paradigmen, gegebenenfalls sollte auch zeigen werden. Eine Reihe von Verhaltensstörungen Aufgaben verwendet, um die funktionellen Ergebnisse im thorakalen Modelle wie der Fuß-Störung-Test und der Basso, Beattie, Breshnan (BBB) Open Field Bewegungsorgane Scale28, Verletzungsgefahr zu testen sind nicht empfindlich genug, um messbare Defizite in unserer minimal zu erkennen SCI-Modell. Um dieses Defizit zu überwinden, kann man machen Verwendung von empfindlicher digital-scoring-Systeme (z.B.Laufsteg), misst mehrere Parameter von grob- und Hind-Limb Fortbewegung Parameter einschließlich Gangart Analysen, die die minimale erkennen können, Defizite infolge minimaler Verletzung Modell29.
Diese Methode könnte auch endogene Aktivierung der NSC als potenzielle Therapie in Modellen der zervikalen Rückenmarksverletzungen untersuchen angepasst werden. Zervikale SCI ist die klinisch relevanten Modell und schlagen wir die Anpassung dieser Verletzungen-Modells zu höheren Wirbelkörper Segmente ob Einblick in würde gibt es regionale Unterschiede in der Reaktion von NSCs und deren Nachkommen (Kinetik, Migration, Differenzierung) und ob die Läsion in tiefer und messbare funktionelle Defizite führen würde. Die aktuell verwendeten murinen zervikalen Verletzungen-Modelle (z.B. Durchtrennung, Clip Kompression und/oder Prellung) benötigen intensive postoperative Versorgung einschließlich der Notwendigkeit, manuell express Harnblasen und überwachen ständig die Atmung der Maus. Anpassung des Modells minimaler Verletzung des zervikalen Rückenmarks kann verringern die Sterblichkeit, Morbidität und postoperative Versorgung verbunden mit anderen zervikalen SCI-Modellen sowie zu prüfen, die Wirksamkeit der Medikamente/kleine Moleküle und/oder Rehabilitation zu ermöglichen Ergebnisse auf neuronale Erholung. Unser Modell der Verletzung kann auch erstelle ich einen minimalen Verletzung in verschiedenen Teilen der Schnur (d.h., dorsal oder seitlichen Spalten) und/oder größere Verletzungen mit tiefer eindringen und/oder den Einsatz von größeren Größe Nadeln (kleiner Gauge) angepasst werden. Dadurch kann den Forscher Kontrolle/manipulieren die Art und Größe der Läsion und zelluläre und funktionale/Verhaltensstörungen Erholung so entsprechend zu bewerten.
Minimaler Verletzung-Modell bei Mäusen ermöglicht den Einsatz von transgenen Tiermodellen. Die Mausmodelle ermöglichen eine Kennzeichnung von körpereigenen Stammzellen und/oder Vorfahren vor der Verletzung. Diese können die Forscher das Schicksal dieser vorher markierten Zellen nach Verletzung zu verfolgen und auswerten neuronaler Vorläufer Zellproliferation, Migration und Differenzierung nach Verletzung – möglicherweise einen Beitrag zur neuralen Reparatur.

Das zentrale Nervensystem enthält eine Subpopulation von selbst erneuernde, multipotente Stammzellen, die alle die verschiedenen Reifen neuronale Zelle Arten1,2,3,4auslösen können. Diese neuronalen Stammzellen (NSCs) befinden sich in spezialisierten Nischen im Gehirn und im Rückenmark und nach Verletzungen zu vermehren, migrieren und differenzieren in ausgereifte Nervenzellen aktiviert werden kann. NSCs und deren Nachkommen haben gezeigt, zu der Verletzung Aufstellungsort in kortikalen Verletzung Modelle5,6migrieren. Im Gehirn nachweislich die NSCs aus der seitlichen Ventrikel an der Stelle der Verletzung zu migrieren, wo sie in Astrozyten, die glial Narbe Bildung7beitragen, zu differenzieren. Im Rückenmark jedoch wurden nur wenige Studien um zu Fragen, ob diese gleichen endogenen NSCs nutzbar gemacht werden können, Förderung der Erholung nach Verletzungen des Rückenmarks durchgeführt. In der Tat gibt es derzeit eine Debatte darüber, ob Aktivierung des Stammzell-Pools im Rückenmark eine direkte physische Schädigung der Auskleidung der zentralen Kanal8 periventrikulären Nische erfordert oder wenn die Schäden an der Wirbelsäule Parenchym (verlassen des Stamms Schnur Zelle Nische intakt) genügt zur Aktivierung endogener NSCs9zur Verfügung.
Eine Reihe von Rückenmark Verletzungen (SCI) Modelle wurden eingesetzt, um die Pathophysiologie der akuten und chronischen Verletzungen zu studieren. Diese Modelle wurden auch zur möglichen Therapien zur Behandlung von SCI durch Neuroprotektion, Immunmodulation und entwickelnden Zelle Transplantation/Ersatz Strategien10,11,13testen. Aktuelle Modelle verfügen über Kompression und/oder Prellung Verletzungen, die groß angelegte funktionelle Defizite sowie umfangreiche Läsionen und Kavitation in der Schnur14,15verursachen. Daraus resultierende glial Narben können mehrere wirbelsäulensegmente zusammen mit der Mehrheit der Breite/Umfang des Rückenmarks16erstrecken. So, während diese Modelle klinisch relevant sind, leisten sie große Herausforderungen für das Studium der Reaktion des endogenen NSCs nach Verletzung. Es gibt chemische Modelle der Verletzung, die um mildere Formen der Verletzung zu verursachen, die den zentralen Kanal17erübrigen können angepasst werden können. Jedoch diese Art von Verletzungen im Fokus der Demyelinisierung SCI zugeordnet und sind keine klinisch relevanten Modelle für die körperliche und/oder mechanische Schäden im Zusammenhang mit traumatischen Sci.
Um die Einschränkungen der aktuellen Modelle der Verletzung zu beheben, haben wir eine Nadel Track minimal SCI-Modell, ursprünglich entwickelt in der Ratte9, für den Einsatz in einer Erwachsenen Maus-Modell angepasst. Unser Modell angepasst Verletzungen erstellen eine konsistentere Läsion der dorsolateralen Region des Rückenmarks Maus und ersparen den Zentralkanal an Ebene(n) Verletzungsgefahr. Der Vorteil dieses Modells ist, dass es die Untersuchung von NSC Kinetik erlaubt nach Verletzungen und ihre mögliche radialen Migration an der Stelle der Verletzung. Die Verwendung von einem Maus-Modell ermöglicht auch den Einsatz von transgenen Mäusen, die Linie Verfolgung von endogenen NSCs und ihre Nachkommen nach Verletzung zu ermöglichen. Die Eigenschaften der NSCs können näher untersucht werden, über eine modifizierte Form des in-vitro- neurosphäre Assays, die in diesem Protokoll eingeführt wird.
Die neurosphäre-Assay ist ein in Vitro koloniebildenden Assay, der die Isolierung der NSCs im Beisein von Mitogene ermöglicht. Bei klonalen Beschichtung dichten vermehren sich einzelne NSCs um freischwebende kugelige Kolonien von Zellen entstehen, die aus einer kleinen Subpopulation von NSCs und eine große Mehrheit der Stammväter18,19bestehen. In unserem Protokoll zeigen wir die Isolierung von zwei unterschiedlichen, Comyn im Zusammenhang mit NSCs aus der periventrikulären Region des Rückenmarks-Basislinie Bedingungen und im Anschluss an unser minimal SCI-Modell. Definitive neuronale Stammzellen Zellen (dNSCs) express nestin und glial fibrillary sauren Protein (GFAP) und in Anwesenheit von epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und Heparin (zusammen benannt EFH)20angebaut. Diese dNSCs sind selten im Rückenmark naiv, was zu sehr wenige neurosphären in Vitro. Wir zeigen jedoch, dass dNSCs nach minimal SCI, erweitert die Zahl der neurosphären isoliert von der periventrikulären Region21aktiviert sind. Primitive neurale Stammzellen (pNSCs) sind oberhalb des dNSCs in der neuronalen Stammzelle Abstammung. pNSCs sind äußerst selten, ausdrückliche niedrigen Niveau der Pluripotenz Markierung Oct4, und Leukämie hemmenden Faktor (LiF) reagieren22. pNSCs bilden keine neurosphären, wenn Sie aus dem Rückenmark Erwachsener Mäuse aufgrund des Vorhandenseins von Myelin basic Protein (MBP) in Primärkulturen isoliert; jedoch pNSC neurosphären von MBP mangelhaft Mäusen isoliert werden und ihre Zahlen sind erweiterte folgende Verletzungen – ähnlich wie bei dNSCs21. Schließlich zeigen wir, dass neurosphären dNSC abgeleitet von der Stelle der Verletzung in frühen Zeiten nach minimal Sci isoliert werden können Diese Ergebnisse zeigen, dass unsere Verletzungen Modell und Assays die Aktivierung Merkmale der periventrikulären NSCs wie ihre Fähigkeit beurteilen können, vermehren sich und Wandern in Reaktion auf eine Verletzung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Agricola Retractor</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">17005-04</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Moria Vannas-Wolff Spring Scissors (Curved)</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">15370-50</td>
			<td style="width:215px;">Customize when ordering to get blunted tips</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Graefe Forceps (Straight, 1x2 Teeth)</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">11053-10</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Extra Fine Graefe Forceps (Curved, Serrated)</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">11152-10</td>
			<td style="width:215px;">Or any other forceps for suturing</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Hartman Hemostats (Straight)</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">13002-10</td>
			<td style="width:215px;">Or any other appropriate for suturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Scalpel Handle #3</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;">10003-12</td>
			<td style="width:215px;">Or any other appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:203px;">Hair clippers</td>
			<td style="width:201px;">amazon.ca</td>
			<td style="width:197px;">https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA</td>
			<td style="width:215px;">or any other appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Stereotaxic instrument</td>
			<td style="width:201px;">Stoeling</td>
			<td align="right">51500</td>
			<td style="width:215px;">or any other appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Buprenorphine</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>or any appropirate sanctioned my animal care facility</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Meloxicam</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td style="width:215px;">or any appropriate sanctioned by animal care facility</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:203px;">Tears Naturale P.M.</td>
			<td style="width:201px;">Alcon</td>
			<td style="width:197px;">https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE</td>
			<td style="width:215px;">or any other appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:203px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:201px;">Baxter International Inc</td>
			<td style="width:197px;">DIN 02225875</td>
			<td style="width:215px;">or any other appropriate for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:203px;">Q-tips Cottom Swabs</td>
			<td style="width:201px;">amazon.ca</td>
			<td style="width:197px;">https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&#38;psc=1&#38;refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Cotton Gauze</td>
			<td style="width:201px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">30G Needles</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:197px;">305106</td>
			<td>For Injury</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">25G Needles</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:197px;">305122</td>
			<td>For Drug injections</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">1mL Syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:197px;">3090659</td>
			<td>for drug injections</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">3mL Syringes</td>
			<td style="width:201px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:197px;">309657</td>
			<td>for fluid injections</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">4-0 Suture</td>
			<td style="width:201px;">uoftmedstore.com</td>
			<td>2297-VS881</td>
			<td>for skin suturing</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">6-0 Suture</td>
			<td style="width:201px;">uoftmedstore.com</td>
			<td>VS889</td>
			<td>for muscle suturing</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Polysporin ointment</td>
			<td style="width:201px;">amazon.ca</td>
			<td align="right">102051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Isoflurane Vaporizer</td>
			<td style="width:201px;">VetEquip</td>
			<td align="right" style="width:197px;">901806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">15mL conical tubes</td>
			<td style="width:201px;">ThermoFisher</td>
			<td></td>
			<td>Any appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:201px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>any appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:201px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Any</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:201px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Any appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:201px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td>Any appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Standard Dissection Tools</td>
			<td style="width:201px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Dissection Microscope</td>
			<td style="width:201px;">Zeiss</td>
			<td style="width:197px;">Stemi 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Counting Microscope</td>
			<td style="width:201px;">Olympus</td>
			<td style="width:197px;">CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Neural Basal-A Medium</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">10888-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">B27</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">17404-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Penicillin- Streptomycin</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:197px;">15070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">L- Glutamine</td>
			<td style="width:201px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:197px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">DMEM</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:197px;">12100046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">F12</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:197px;">12700075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">30% Glucose</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">G6152</td>
			<td>1M- 9.01g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">1M Glucose</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">7.5% NaHCO3</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">S5761</td>
			<td>155mM- 1.30g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">155mM NaHCO3</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:203px;">1M HEPES</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">H3375</td>
			<td>23.83 g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Apo-Transferrin</td>
			<td style="width:201px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:197px;">3188-AT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Putrescine&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">P7505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Insulin</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">I5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Selenium</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">S9133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Progesterone</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">P6149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Papain Dissociation System&#160;</td>
			<td style="width:201px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td style="width:197px;">PDS</td>
			<td>1 vial of papain can be used for 2 samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Epidermal Growth Factor</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">PMG8041</td>
			<td>Powder reconstituted with 1mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">Fibroblast Growth Factor</td>
			<td style="width:201px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">PHG0226</td>
			<td>Powder reconstituted with 0.5mL Hormone Mix and aliquoted into 20uL vials to be stored in freezer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Heparin</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">H3149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:201px;">In House</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:201px;"></td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:203px;">24 well Plates</td>
			<td style="width:201px;">NUNC</td>
			<td style="width:197px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">2M NaCl</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">S5886</td>
			<td>11.69g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">1M KCL</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">P5405</td>
			<td>7.46g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">1M MgCl2</td>
			<td style="width:201px;">Sigma</td>
			<td style="width:197px;">M2393</td>
			<td>20.33g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">108mM CaCl2</td>
			<td style="width:201px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:197px;">C7902</td>
			<td>1.59g in 100mL dH2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a neurosphere assay to evaluate endogenous neural stem cell activation in a mouse model of minimal spinal cord injury

Neurale Stammzellen (NSCs) im Erwachsenen Säugetier Rückenmark sind relativ mitotically Ruhestrom Einwohner periventrikulären Zellen, die studierte in Vitro mit neurosphäre Assay werden können. Dieser Assay koloniebildenden ist ein mächtiges Werkzeug um die Reaktion der NSCs auf exogene Faktoren in einer Petrischale zu studieren; jedoch kann auch hiermit, die Wirkung von in Vivo Manipulationen mit das richtige Verständnis der Stärken und Grenzen des Tests zu studieren. Eine Manipulation der klinischen Interesse ist die Wirkung von Verletzungen auf endogene Aktivierung der NSC. Aktuelle Modelle von Verletzungen des Rückenmarks sind eine Herausforderung, diese zu studieren, da die Schwere der gemeinsamen Prellung, Komprimierung und Durchtrennung Modelle führen die Zerstörung der NSC Nische an der Stelle der Verletzung wo die Stammzellen befinden. Hier beschreiben wir ein minimaler Verletzung-Modell, das an der oberflächlichen dorsolateralen Oberfläche der unteren thorakalen Ebene (T7/8) des Rückenmarks Erwachsenen Maus lokalisierte schädigt. Dieses Modell Verletzungen erspart den zentralen Kanal auf der Ebene der Verletzungen und ermöglicht Analyse von NSCs, die auf der Ebene der Läsion zu verschiedenen Zeitpunkten nach Verletzung befinden. Wir zeigen hier, wie die neurosphäre Assay genutzt werden kann, um die Aktivierung von zwei unterschiedlichen, Comyn-bezogenen, Populationen von NSCs zu studieren, die in das Rückenmark periventrikulären Region - primitiv und definitive NSCs befinden (pNSCs und dNSCs, beziehungsweise). Wir zeigen, wie zu isolieren und Kultur Diese NSCs aus der periventrikulären Region auf der Ebene der Verletzungen und der weißen Substanz Verletzung Aufstellungsort. Unsere Post-op Rückenmark Sezierungen zeigen vermehrt pNSC und dNSC abgeleitet neurosphären aus der periventrikulären Region des verletzten Schnüre im Vergleich zu Kontrollen, zu deren Aktivierung über Verletzungen sprechen. Darüber hinaus nach Verletzungen, dNSC abgeleitet neurosphären isoliert werden aus Verletzung Aufstellungsort – Nachweis der Fähigkeit der NSCs aus ihrer Nische periventrikulären auf Seiten der Verletzung zu migrieren.

Nach der Operation sollten die Mäuse minimale motorische Defizite erleben inklusive Schweif und mögliche Hind-Limb-Parese für bis zu 24 h. Nach dieser Zeit sollten die Mäuse keine Lähmung der hinteren Gliedmaßen und/oder Parese und minimale Veränderungen in Gang erleben.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Ergebnisse aus der neurosphäre Test 5 Tage nach der minimalen Rückenmark-Verletzung. Die absoluten Zahlen der dNSC abgeleitet neurosphären (gewachsen in EFH) ist größer als die Zahl der pNSC abgeleitet neurosphären (gewachsen in LIF) nach einer Verletzung (Abb. 3A und 3 b, beziehungsweise). Bilder mit höherer Leistung eine definitive neurosphäre (Abbildung 3) und eine primitive neurosphäre (Abbildung 3D) zeigen Unterschiede in der Darstellung dieser verschiedenen Kolonien mit endgültigen neurosphären ist größer im Durchmesser (≥80 µm) und in der Regel haben Sie ein großes dunkles Zentrum. Primitive neurosphären sind kleiner (≥50 µm) und die Zellen sind mehr dicht gepackt. Repräsentative Zahlen von Neurospheres aus verschiedenen Teilen des verletzten Rückenmarks sind in Abbildung 3E (Dauermarken) und 3F (primitive) gesehen. Abbildung 3E zeigt, die dass die minimale SCI eine deutliche Steigerung in neurosphären gewachsen aus dem zentralen Kanal auf der Ebene der Verletzung verursacht im Vergleich zu eine relativ geringfügige Erhöhung an die rostral Schnur nicht verletzt.
Interessanterweise können endgültige neurosphären von der Seite der Läsion, einer Region enthalten nicht neurosphäre bildenden Zellen in Laminektomie allein Mäuse generiert werden. Abbildung 3F zeigt eine ähnliche Zunahme der pNSCs nach der Verletzung mit Ausnahme von pNSC neurosphären am Standort Läsion. Nur dNSCs sind daher in der Lage, auf der Stelle der Verletzung über diese Zeit Kurs nach der Verletzung zu migrieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57727/57727fig1v2.jpg"> Abbildung 1: chirurgischer Eingriff. (A) das Layout aller erforderlich, nummeriert als Referenz. (B) ein Bild von der Maus in einem stereotaktischen Gerät mit einem begradigten Körper, Wirbelsäule und Extremitäten ausbreiten und mit Klebeband zusammen mit thorakalen Bogen unter gebracht. (C) A Bild der Maus mit einem vertikalen Hautschnitt Freilegung der Muskelschicht und die Kontur der Wirbelsäule. (D) ein Bild des Körpers nach muskuläre Einschnitte und Exposition und Isolierung der Wirbelsäule mit Retraktoren Maus. Beachten Sie straff Muskelschichten mit mangelnder reißen. (E) ein Bild von der isolierten Maus Wirbelsäule mit Muskelschichten entfernt, zeigt die knöcherne Fläche des Wirbels (3 Segmente). Dies zeigt auch der Dornfortsatz und möglicherweise die Bandscheiben Gelenk und Lamina des mittleren Wirbel entfernt werden. (F) A Bild von der sichtbaren Rückenmark nach Laminektomie. Gekennzeichnet ist die dorsalen Mittellinie Ader. (G) A Bild der Maus mit bilateralen Nadel Track Verletzungen auf beiden Seiten der dorsalen Mittellinie Vene. Es gibt ein close-up Einsatz der 45° gebogene Welle 30 G Nadel. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57727/57727fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57727/57727fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Rückenmark Dissektion. (A) A Bild der enthaupteten Maus mit der Mittellinie Hautschnitt, der Rückenmuskel und vertebralen Knochen Kontur (B) ein Bild von der isolierten Wirbelsäule zeigt rostral und kaudalen Orientierung aussetzen. Das zweite Bild zeigt die Isolierung der Kabel und die dritte zeigt das isolierte Rückenmark in einer Petrischale. (C) eine grafische Darstellung der feinen Dissektion des Rückenmarks, wo verschiedene Segmente (periventrikulären, Verletzungen Bereich) entnommen und getrennt für die Kultivierung. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57727/57727fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57727/57727fig3v3.jpg"> Abbildung 3: Vertreter ergibt sich aus neurosphäre Assay nach minimalen Rückenmarksverletzung. (A) die Nummern der dNSC abgeleitet neurosphären (gewachsen in EFH) kultiviert aus dem verletzten Rückenmark ist größer als (B) die Anzahl der pNSC abgeleitet neurosphären (aufgewachsen in LIF), wenn bei gleicher Dichte beschichtet. (C, D) Bilder mit höherer Leistung von "typischen" Neurospheres in (C) dNSC und (D) pNSC Kulturen. (E) Minimal Nadel Trakt Verletzung führt zu erheblichen Anstieg der Zahl der neurosphären dNSC abgeleitet von den zentralen Kanal auf der Ebene der Verletzung sowie den zentralen Kanal rostral zur Schädigung und Verletzung Aufstellungsort. (F) pNSC abgeleitet neurosphären nicht isoliert von der unverletzten Schnur werden aber nach Verletzungen durch den zentralen Kanal (auf der Ebene der Verletzung und von der Höhlung Zentralkanal) isoliert werden. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler des Mittelwerts. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57727/57727fig3v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Ein Neurosphäre Assay auszuwertende endogenen neurale Stammzellen Aktivierung in einem Mausmodell der minimalen Spinal Cord Injury

Hier zeigen wir die Leistung eines minimalen Rückenmark Verletzungen Modells in einer Erwachsenen Maus, die den zentralen Kanal Nische Gehäuse endogenen neurale Stammzellen (NSCs) erspart. Wir zeigen, wie neurosphäre Assay verwendet werden kann, um Aktivierung und Migration der definitive und primitiven NSCs nach Verletzung zu quantifizieren.

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

a-neurosphere-assay-to-evaluate-endogenous-neural-stem-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.8K Aufrufe.  University of Toronto. Hier zeigen wir die Leistung eines minimalen Rückenmark Verletzungen Modells in einer Erwachsenen Maus, die den zentralen Kanal Nische Gehäuse endogenen neurale Stammzellen (NSCs) erspart. Wir zeigen, wie neurosphäre Assay verwendet werden kann, um Aktivierung und Migration der definitive und primitiven NSCs nach Verletzung zu quantifizieren.

Serie: A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Isolation und Expansion der erwachsenen Maus Neural Stem Cells mit dem Neurosphäre Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

Gründung Embryonale Maus Neural Stem Cell Culture Mit dem Neurosphäre Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

Neural-Colony Forming Zell-Assay: Ein Test zur Bona Fide neuralen Stammzellen aus neuralen Vorläuferzellen Discriminate

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Lateral Fluid-Percussion: Modell Schädel-Hirn-Verletzungen in Mäuse

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Neuronalen Aktivität im primären somatosensorischen Cortex mit Thy1Imaging-GCaMP6s transgene Mäuse

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Intra-arterielle Lieferung von neuronalen Stammzellen an das Ratten- und Maushirn: Anwendung auf zerebrale Ischämie

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

Induktion von vollständiger Transektion-Typ Rückenmarksverletzung bei Mäusen

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...