Diese Studie erhielten finanzielle Unterstützung von NINR (F32NR013611). Wir möchten weiter bestätigen und danken den Entwicklern von AnalyzeSkeleton(2D/3D) und FracLac (Arganda Carreras Et Al. und Karperien Et Al., beziehungsweise) ohne den hier beschriebene Analyse nicht möglich wäre.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Mikroglia-Zellen sind abgestimmt auf die Physiologie und Pathologie innerhalb ihrer mikrodomänen und ein breites Spektrum von Morphologien2 im subtilen7,14 und grober Verletzung8anzeigen. Die Verwendung von ImageJ Protokollen macht Mikroglia Morphologie Quantifizierung als Plattform für alle Laboratorien zugänglich und Plugins sind ein Open-Source-Bildbearbeitungsprogramm. Während die beschriebene Protokoll auf Bildverarbeitung und-Analyse mit dieser Software gerichtet ist, beginnt die Konsistenz der Datensammlung, Validität und Reliabilität mit ausgezeichneten IHC und Mikroskopie. Dieses Protokoll wird verwendet, um binäre, Skelett und Gliederung Darstellungen der gesamten Mikrofotos und Einzelzellen zu verbessern, aber kann nicht an die Stelle der Armen IHC beflecken und Mikroskopie, die Ergebnisse in geringem Kontrast, unscharf oder verzerrt Bilder. Als eine weitere Überlegung muss darauf geachtet werden, nicht auf das Hirngewebe während der Lagerung vor dem Schneiden, glätten, das Mikroglia Morphologie unwiderruflich verändert. Zu guter Letzt muss innerhalb jedes Experiment Mikroglia abgebildet werden mit der gleichen Skala sowie die gleichen Mikroskop. Instrumentierung, Ziele und Software variieren unter Mikroskopen die führen zu unterschiedlicher Größe Mikrofotos trotz ähnlicher Zielsetzung und ändern Sie die Details sowie die Anzahl der Zellen in jedem Frame. Bildaufnahme mit einem 40 X Objektiv auf eine Leica SPII ergibt beispielsweise zweimal die Anzahl der Zellen und weniger Details als Erwerb mit einem Zeiss-880. Dies ist besonders wichtig für die Zelle Verzweigung Daten aus den gesamten Rahmen, anstatt eine einzelne Zelle, da dies ein Problem der Daten Probenahme wird.
In der Regel vorausgeht Skelett Analyse, die die gesamte Mikrophotographie nutzt die einzelne Zelle Fraktal-Analyse aus zwei Gründen. Bestimmende Zelle Verzweigung aller Zellen in einem Mikrophotographie ist schnell im Vergleich zu der einzelnen Zelle Fraktalanalyse und als ein Screening-Instrument angesehen werden, kann wenn Zeit ein Faktor ist. Darüber hinaus werden die binären Bildern abgeleitet während Skelett Analyse für Fraktalanalyse verwendet. Sobald ein Image erstellt, gibt es eine Reihe von kritischen Schritte, die Einfluss Skelett Analyseergebnisse und Benutzer-Einfluss vorstellen kann. Die Protokoll-Schritte, die meisten variabel zwischen Benutzern sind Schritt 4.2 (zunehmende Helligkeit) und 4,5 (Bestimmung des Schwellenwerts). Soweit möglich, wird eine optimale Anzahl Erhöhung der Helligkeit (Max oder min Schieberegler zwischen 0-255) bestimmt und für alle Bilder und Anwender konstant gehalten. Wo Bild Variabilität groß ist, können die Benutzer stattdessen eine Helligkeit, die zwischen den Bildern variieren. Alternativ, wenn Bilder hell sind und Kontrast hoch ist, dann Helligkeit erhöhen kann weggelassen werden und Schwellwerte kann mithilfe eines Filters Spezialität Schwelle standardisiert werden (zB., Huang) anstatt die variablere Standard. Sobald optimiert, sollte die Parameter eingehalten werden um zusätzliche Benutzer-Einfluss zu minimieren.
Ein Beispiel für Benutzer Variabilität ist in Abbildung 5dargestellt. Datenwerte wurden in User 1 versus User 2 erhöht und daher würde die Variabilität erhöht werden, wenn Benutzer 1 und Benutzer 2 zur Datenerhebung beigetragen. Ein Beispiel für die Unterschiede in der Benutzer 1 und Benutzer 2 binäre und skelettierten Bilder sind deutlich durch farbige Kreise (Abbildung 5). In diesem Fall waren beide Benutzer kurz ausgebildeten Studenten mit begrenzten Expertise in der Mikroglia. Regelmäßige Kontrolle und Betreuung durch einen Experten zusammen mit erhöhten Protokoll Training2 Mikroglia können Inter Benutzer Variabilität reduzieren. Obwohl hier nicht bewertet, ist Fraktalanalyse weniger anfällig für Inter Benutzer Variabilität da binäre Zellen einzeln und manuell von einem Mikrophotographie, anstatt allein auf Schnittstellenüberwachung Mikroglia Formen bestimmen isoliert sind. Alle Methoden besitzen jedoch eine gewisse Variabilität zwischen den Nutzern. Daher ein einzelner Benutzer (im Idealfall ausgebildet durch einiges an Fachwissen in Mikroglia-Zellen) sollte die Datensammlung für eine gesamte Dataset abgeschlossen.
Zusätzliche Änderungen dieses Protokolls leicht erfolgen können und hängt die Bildqualität und die Bemühungen zur Reduzierung von Lärm und Prozess-Konnektivität zu gewährleisten. Zum Beispiel, wenn Kontrast ausreicht, dann Unscharf maskieren ist nicht notwendig und kann weggelassen werden. Es ist ratsam, zu optimieren und das Protokoll für eine bestimmte Gruppe von Bildern, experimentelle Fälle und Kontrollen, vor dem Sammeln von Daten aus einem ganzen Satz abzuschließen. Zu guter Letzt zusätzliche Plugins verwendet werden, anstelle von anderen zu formulieren oder zu schärfen Bilder, die in diesem Protokoll nicht beschrieben wurden wie zu dehnen oder zu schärfen.
Vorteile dieses Protokolls sind seine universelle Verfügbarkeit und Anpassungsfähigkeit. Darüber hinaus ist die Beurteilung Zelle Verzweigung mit AnalyzeSkeleton schnell und auf eine gesamte Mikrophotographie anwendbar. Ein Vorteil der multizelle Analyseansatz ist der Fokus auf einer ganzen Region anstatt einzelner Zellen. Daher ist es möglich, die durchschnittliche Auswirkung (in Bezug auf die Endpunkte und Prozess-Länge) alle Mikroglia im Bild schnell zu beurteilen. Skelett-Analyse liefert eine Analyse mehrerer Zellen: eine Auswahl der Daten in Bezug auf die Anzahl der Zellen, die nicht von Fraktalanalyse aufgrund der erforderlichen Zeit Investitionen, einzelne Zellen von Mikrofotos isolieren abgestimmt werden. Eine Instanz, wo dies am besten geeignet sein könnte, wäre in screening-Mikroglia Morphologien in Nähe einer fokalen Verletzung. Eine Einschränkung ist, dass das ganze Feld Bildrendering Skelettmodelle IHC Mikrofotos erstellen unvollkommen im Vergleich zu der zeitaufwändiger Einzelzelle Ansatz ist. Darüber hinaus sind eine regionsanalyse nicht Umständen angemessen Mikroglia Morphologien drastisch unterschiedlich im gleichen Bereich. Zu guter Letzt ist diese Analysemethode abhängig von Zellzahl, ein Parameter, der zwischen experimentellen Bedingungen abweichen.
Fraktalanalyse erfolgt auf eine einzelne Zelle und ergänzt somit die durchschnittliche Zelle Verzweigung Datenausgabe aus dem Skelett Analyse. Obwohl viel mehr zeitaufwendig, verschiedenste morphometrische Daten diese Investition bringt. Z. B. Zelle Dichte, Span-Verhältnis und Zirkularität Daten beschreiben die Größe, die Dehnung und die Form der Zelle Gliederung, beziehungsweise. Fraktale Dimension und Lacunarity fassen die Zelle Komplexität und Heterogenität der Form, beziehungsweise. Eine ausführlichere Zusammenfassung der wie jeder Parameter berechnet wird und wie Daten interpretiert werden können finden Sie in der interaktiven manuelle16 und so detailliert betrachtet werden, in Bezug auf die spezifische Fragestellung. Das beschriebene Protokoll führt zu empfindlichen Werkzeuge, kleine Änderungen in 2D Mikroglia Morphologien zu quantifizieren, die unter physiologischen und pathologischen Bedingungen auftreten können. Zusätzliche morphometrische Analyse wie Solidität, Konvexität und Form Faktor16,20 wenn 3D-Formen erzeugen möglicherweise.
Protokollentwicklung und Anpassung ist kontinuierlich und nutzerorientierten. Es wurde von Fluoreszenz8 DAB/Hellfeld Bilder7 aber noch nicht zu paraffin eingebettete Gewebe ausgedehnt. Es außerdem für zusätzliche Analysen in Verbindung mit proprietärer Software wie Imaris einsetzbar. Dieses Protokoll kann auch auf eine Vielzahl von Physiologie und beschränkt sich nicht auf Mikroglia aber angewandt werden, um jede Zelle oder eines Gewebes mit bestimmten Mustern oder Formen, die mit IHC Methoden identifiziert werden können. Mit ausreichender Stichprobengröße kann schließlich eine Multivariate oder Cluster-Analyse angewendet werden, um Schichten Mikroglia nach Morphologie12,21; Dies ist sinnvolle Informationen wie Mikroglia Morphologie ein wichtiger Indikator der Mikroglia Funktionen und Reaktionen auf ihre Umgebung ist. Die Wertschätzung für die Mikroglia morphologische Vielfalt ist expandierenden und zum Verständnis wichtig Neuron-Glia-Kreislauf Interaktionen in Gesundheit und Krankheit. Wachstum in diesem Bereich wird ergänzt durch gut ausgebaute, einfach zu bedienen und reproduzierbare Protokolle zu quantifizieren und Mikroglia Morphologie mit mehreren kontinuierlichen Variablen zusammenfassen.

Mikroglia haben eine sofortige und vielfältigen morphologischen Antwort auf Veränderungen im Gehirn Physiologie1 entlang eines Kontinuums von Möglichkeiten dieses Bereichs von hyper-Verzweigung und hochkomplexe Morphologien, de-verzweigten und amöboiden Morphologien2 . Mikroglia kann auch polarisiert und stabförmige3geworden. Mikroglia Zelle Verzweigung wird im Allgemeinen als eine komplexe Form mit mehreren Prozessen definiert und wird oft als die Anzahl der Endpunkte pro Zelle und die Länge der Zelle Prozesse berichtet. Da Mikroglia sind abgestimmt auf neuronalen und Gliazellen Funktion durch kontinuierliche Zellezelle Übersprechen und in Vivo Motilität4,5, können als Indikatoren für verschiedene Zellfunktionen und Dysfunktionen Mikroglia Morphologien dienen. im Gehirn. Ein quantitativer Ansatz ist notwendig, um die Vielfalt dieser morphologischen Veränderungen angemessen zu beschreiben und die Unterschiede zwischen den verzweigten Zellen zu unterscheiden, die mit subtilen physiologische Störungen (z. B. Epilepsie5,6 auftreten und Gehirnerschütterung7) zusätzlich zu grobe Verletzungen (z. B. Takt8). Ein vermehrter Einsatz von Morphologie Quantifizierung7,8,9,10,11,12,13,14 zeigen die ganze Vielfalt der Mikroglia Morphologien in Gesundheit und Krankheit. Die vorliegende Studie Details der schrittweise Einsatz von ImageJ Plugins notwendig, Mikroglia Morphologie von Leuchtstofflampen oder nicht-fluoreszierende Vergößerung der Mikroglia zusammenfassen in festen Nagetier Gewebe nach Immunhistochemie (IHC) erworben.
Im Mittelpunkt stehen, die Analyse-Techniken, die hier beschriebenen die ImageJ Plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, entwickelt im Jahr 2010 auf große Mamma Strukturen, zu quantifizieren und FracLac16, entwickelt im Jahr 2014 auf ImageJ und Fraktal-Analyse zu integrieren einzelnen Mikroglia Formen zu quantifizieren. Diese Plugins bieten eine schnelle Analyse der Mikroglia Verzweigung im gesamten Mikrofotos oder mehrere Mikroglia einen definierten ROI innerhalb einer Mikrophotographie. Diese Analyse kann alleine oder in Ergänzung mit Fraktalanalyse verwendet werden. Die einzelligen Fraktalanalyse (FracLac) erfordert eine Investition von Zeit, sondern bietet mehrere Morphologie Ausgaben bezüglich Mikroglia Komplexität, Form und Größe. Die Verwendung beider Tools ist nicht überflüssig, als Zelle Verzweigung ist komplementär zur Zelle Komplexität und die Kombination von mehreren Parametern verwendet werden, zu unterscheiden zwischen verschiedenen Mikroglia Morphologien in Datasets12,17.

<table><tbody><tr><td>primary antibody anti-IBA1</td><td>Wako&amp;nbsp;</td><td>019-19741</td><td>rabbit host</td></tr><tr><td>Vectashield soft mount</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>donkey host</td></tr><tr><td>4 mL glass vial</td><td>Wheaton</td><td>UX-08923-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>glass coverslip</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-544-G</td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying microglia morphology from photomicrographs of immunohistochemistry prepared tissue using imagej

Mikroglia sind Gehirn Fresszellen, die im Gehirn Homöostase teilnehmen und kontinuierlich vermessen ihr Umfeld für Funktionsstörungen, Verletzungen und Krankheiten. Als die first Responder Mikroglia haben wichtige Funktionen, Neuronen und Glia Dysfunktion zu mildern, und in diesem Prozess durchlaufen sie eine breite Palette von morphologischen Veränderungen. Mikroglia Morphologien können deskriptiv eingestuft werden oder alternativ als eine kontinuierliche Variable Parameter wie Zelle Verzweigung, Komplexität und Form quantifiziert werden können. Während Methoden zur Quantifizierung der Mikroglia auf einzelne Zellen angewendet werden, gelten einige Techniken für mehrere Mikroglia in eine gesamte Mikrophotographie. Der Zweck dieser Methode ist, mehrere zu quantifizieren und Einzelzellen mit leicht verfügbaren ImageJ-Protokolle. Dieses Protokoll ist eine Zusammenfassung der Schritte und ImageJ Plugins empfohlen, Fluoreszenz und Hellfeld Vergößerung in repräsentativen binäre und skelettierten Bilder umzuwandeln und zu analysieren mit Software-Plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) und FracLac für die Datenerfassung der Morphologie. Die Ausgänge dieser Plugins zusammenfassen Zellmorphologie Prozess Endpunkte, Kreuzungen, und Länge sowie Komplexität, Zelle Form und Größe Deskriptoren. Das Skelett Analyse Protokoll beschriebenen eignet sich gut für eine regionale Analyse von mehreren Mikroglia innerhalb eines gesamten Mikrophotographie oder Region of Interest (ROI), während FracLac eine ergänzende individuelle Zellanalyse bietet. Kombiniert, sieht das Protokoll ein objektives, sensible und umfassende Bewertungswerkzeug, das verwendet werden, um zwischen vielfältigen Mikroglia Morphologien im Gehirn gesund und Verletzten zu Schichten.

Die Mikroglia Morphologie Analyseprotokolle beschriebenen zusammenfassen Schritte bei der Bearbeitung von Leuchtstofflampen und DAB Mikrofotos für morphometrische Analyse hilfreich. Diese Schritte werden in Abbildung 2 optisch zusammengefasst und Abbildung 3. Das Ziel dieser Schritte ist ein repräsentatives Bild der binären und skelettierten erstellen, das entsprechend der ursprünglichen Mikrophotographie Modelle, so dass die angesammelten Daten gültig sind. Nach Protokoll Anwendung ergeben das AnalyzeSkeleton-Plugin tagged Skelett Bilder aus denen die Anzahl der Endpunkte und Zweig (dh., Prozess) Lengthcan von daraus resultierenden Ausgabedateien zusammengefasst werden. Endpunkte und Länge Prozessdaten werden dann verwendet, um das Ausmaß der Mikroglia Verzweigung in der Mikrophotographie oder ROI zu schätzen. Abbildung 4 fasst die resultierenden Daten (Endpunkte und Prozess/Länge/Zelle) mit und ohne Protokoll Anwendung. Während ähnliche Tendenzen vorhanden sind, sind die Daten zusammengefasst in Abbildung 4F weniger Variable als in Abbildung 4E. Diese Daten veranschaulichen darüber hinaus erhöhten Empfindlichkeit zur Erkennung Unterschiede zwischen den Gruppen, wenn das Protokoll angewendet wird. Zu guter Letzt muss darauf geachtet werden, über Inter Benutzer Variabilität in der Anwendung des Protokolls. Solche Unterschiede sind in Abbildung 5 zusammengefasst wo demselben Datensatz durch zwei unabhängige Benutzer, die Anwendung eines identischen Protokolls wie oben zusammengefasst analysiert wurde.
Zusätzliche Morphologie Daten werden aus einzelnen Zellen isoliert von den binären Bildern während der Protokoll-Anwendung erstellt. Die Protokoll-Schritte zu analysieren, Mikroglia Morphologie vor und mit das FracLac-Plugin sind in Abbildung 6zusammengefasst. Wir illustrieren diese Analyse in beide unverletzt (Abb. 6A) und (Abb. 6 b) Gewebe verletzt. Repräsentative Bilder von binären, skizzierte, konvexen Rumpf/Verkapselung Kreis und Feld zählen Beispiele für jede Zelle analysiert mit und ohne das Protokoll Anwendung sind in Abbildung 6–F. Diese Bilder helfen, die Ursprünge der Unterschiede in der Morphologie Daten veranschaulichen, die in Abbildung 6zusammengefasst sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg"> Abbildung 1: Abbildungen der skelettierten Mikroglia mit einer kreisförmigen Soma (suboptimale) im Vergleich zu einem einzigen Ursprung Soma (optimal) und die entsprechende Überlagerung zwischen der skelettierten Zelle und die ursprüngliche Mikrophotographie. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg"> Abbildung 2: Protokoll Anwendung auf fluoreszierende oberflächenmustern. Abbildungen des Protokolls Skelett Analyse auf eine fluoreszierende Mikrophotographie mit einer einzelnen Zelle angewendet abgeschnitten, um Details anzuzeigen. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg"> Abbildung 3. Protokolls Anwendung Hellfeld DAB oberflächenmustern. Abbildungen des Protokolls Skelett Analyse angewendet, ein Hellfeld DAB Mikrophotographie mit einer einzelnen Zelle beschnitten, um Details anzuzeigen. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg"> Abbildung 4. Datenanalyse mit und ohne Protokoll Anwendung. (A) ein Beispiel Mikrophotographie fluoreszierende IHC und beschnittenen Zelle, die den gelben Kasten unter (B). Binäre und skelettierten Beispielbilder mit (C) und ohne (D) das Protokoll angewendet wie beschrieben. Zusammenfassung der Daten der Mikroglia Endpunkte und Prozess/Länge/Zelle in unverletzt (weiß) und verletzte (grau) kortikalen Gewebe mit (E) und ohne (F) das Protokoll angewendet. Statistische Analyse mit Hilfe des Student t-Test und n = 3, ** p < 0,01 bezeichnet. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg"> Abbildung 5. Benutzer-Unterschiede mit Protokoll Anwendung. Ein Beispiel für ein original Bild und Protokoll Umstellung auf binäre und Skelett Bilder von Benutzer 1 und Benutzer 2. Unterschiede zwischen den beiden Bildern sind mit passenden farbigen Kreise hervorgehoben. Zusammenfassende Graphiken von Mikroglia Endpunkte/Zelle und Prozessdaten Länge/Zelle in unverletzt und Geschädigten Hirnregionen von Benutzer 1 und Benutzer 2. Statistische Auswertung ANOVA mit Probe beträgt n = 3; p < 0,05, **p < 0,01 ***p < 0,001. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg"> Abbildung 6. Fraktalanalyse mit und ohne Protokoll Anwendung. Beispiel für verkürzte Vergößerung der Mikroglia im unverletzten (A) und verletzte (B) Kortex mit entsprechenden binären (C) und Gliederung (D) Bilder, die mit und ohne das Protokoll angewendet ergeben. Die damit verbundenen konvexe Hülle (blau) und umschließenden Kreis (rosa) für die entsprechende Kontur Formen (E) werden verwendet, um Form Dichte berechnen, erstrecken sich über Verhältnis und Zirkularität (G). Feld Zählmethode ist illustriert (F) und für die Fraktale Dimension (D-B) und Lacunarity (λ) Berechnungen (G) verwendet. Maßstabsleiste = 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Mikroglia sind immun Gehirnzellen, die Umfrage und reagieren auf veränderte Gehirnphysiologie durch morphologische Veränderungen, die quantitativ ausgewertet werden kann. Dieses Protokoll beschreibt eine ImageJ basierte Analyse Protokoll, Mikroglia Morphologie als kontinuierliche Daten nach Metriken wie Zelle Verzweigung, Komplexität und Form darzustellen.

Quantifizierung der Mikroglia Morphologie von Mikrofotos von Immunohistochemistry vorbereitet Gewebe mit ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

quantifying-microglia-morphology-from-photomicrographs

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

66.3K Aufrufe.  University of Arizona. Mikroglia sind immun Gehirnzellen, die Umfrage und reagieren auf veränderte Gehirnphysiologie durch morphologische Veränderungen, die quantitativ ausgewertet werden kann. Dieses Protokoll beschreibt eine ImageJ basierte Analyse Protokoll, Mikroglia Morphologie als kontinuierliche Daten nach Metriken wie Zelle Verzweigung, Komplexität und Form darzustellen.

Serie: Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Forschung

Biotechnik

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Neurowissenschaften

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

In Vivo Dynamics of Retinal Mikrogliaaktivierung Während Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoskopische Imaging and Cell Morphometrie in Maus Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Medizin

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ), a well-established model for glutamatergic synapses, has been extensively studied for decades. Identification of mutations causing NMJ morphological defects revealed a repertoire of genes that regulate synapse development and function. Many of these were identified in large-scale studies that focused on qualitative approaches to detect morphological abnormalities of the Drosophila NMJ. A drawback of qualitative analyses is that many subtle players contributing to NMJ morphology likely remain unnoticed. Whereas quantitative analyses are required to detect the subtler morphological differences, such analyses are not yet commonly performed because they are laborious. This protocol describes in detail two image analysis algorithms "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics", available as Fiji-compatible macros, for quantitative, accurate and objective morphometric analysis of the Drosophila NMJ. This methodology is developed to analyze NMJ terminals immunolabeled with the commonly used markers Dlg-1 and Brp. Additionally, its wider application to other markers such as Hrp, Csp and Syt is presented in this protocol. The macros are able to assess nine morphological NMJ features: NMJ area, NMJ perimeter, number of boutons, NMJ length, NMJ longest branch length, number of islands, number of branches, number of branching points and number of active zones in the NMJ terminal.

Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology

Two image analysis algorithms, "Drosophila NMJ Morphometrics" and "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" were created, to automatically quantify nine morphological features of the Drosophila neuromuscular junction (NMJ).

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuromuskuläre Junction Morphology

Synaptic morphology is tightly related to synaptic efficacy, and in many cases morphological synapse defects ultimately lead to synaptic malfunction. The ...

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either fluorescence detection approaches, such as immunofluorescent staining or transfection with fluorescent proteins or edge detection techniques, which are often error-prone due to noise and other non-idealities in the image background. 
We designed a new algorithm that could accurately count and distinguish macrophages and fibroblasts, cells of different phenotypes that often colocalize during tissue regeneration. MATLAB was used to implement the algorithm, which differentiated distinct cell types based on differences in height from the background. A primary algorithm was developed using an area-based method to account for variations in cell size/structure and high-density seeding conditions. 
Non-idealities in cell structures were accounted for with a secondary, iterative algorithm utilizing internal parameters such as cell coverage computed using experimental data for a given cell type. Finally, an analysis of coculture environments was carried out using an isolation algorithm in which various cell types were selectively excluded based on the evaluation of relative height differences within the image. This approach was found to accurately count cells within a 5% error margin for monocultured cells and within a 10% error margin for cocultured cells.

We present a method, which utilizes a generalizable area-based image analysis approach to identify cell counts. Analysis of different cell populations exploited the significant cell height and structure differences between distinct cell types within an adaptive algorithm.

Area-based Image Analysis Algorithm zur Quantifizierung von Makrophagen-Fibroblasten-Kokulturen

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia selectively), when combined with IBA1 (which provides an exceptional visualization of their morphology), allows investigation of changes in density, distribution, and morphology. Quantifying these parameters is important in providing insights into the roles exerted by microglia, the resident macrophages of the brain. Under normal physiological conditions, microglia are regularly distributed in a mosaic-like pattern and present a small soma with ramified processes. Nevertheless, as a response to environmental factors (i.e., trauma, infection, disease, or injury), microglial density, distribution, and morphology are altered in various manners, depending on the insult. Additionally, the described double-staining method allows visualization of infiltrating macrophages in the brain based on their expression of IBA1 and without colocalization with TMEM119. This approach thus allows discrimination between microglia and infiltrating macrophages, which is required to provide functional insights into their distinct involvement in brain homeostasis across various contexts of health and disease. This protocol integrates the latest findings in neuroimmunology that pertain to the identification of selective markers. It also serves as a useful tool for both experienced neuroimmunologists and researchers seeking to integrate neuroimmunology into projects.

This protocol describes a step-by-step workflow for immunofluorescent costaining of IBA1 and TMEM119, in addition to analysis of microglial density, distribution, and morphology, as well as peripheral myeloid cell infiltration in mouse brain tissue.

Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Immunologie und Infektion

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...

Durchflusszytometrie-basierte Assays für das mikrogliale Engulfment von synaptischen Materialien

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this process; however, currently available methods for identifying microglial engulfment of synapses, such as immunohistochemistry (IHC) and imaging, are laborious and time-intensive. To address this challenge, herein we present in vitro and in vivo* assays that allow fast and high-throughput quantification of microglial engulfment of synapses using flow cytometry.
In the in vivo* approach, we performed intracellular vGLUT1 staining following fresh cell isolation from adult mouse brains to quantify engulfment of vGLUT1+ synapses by microglia. In the in vitro synaptosome engulfment assay, we used freshly isolated cells from the adult mouse brain to quantify the engulfment of pHrodo&#160;Red-labeled synaptosomes by microglia. These protocols together provide a time-efficient approach to quantifying microglial engulfment of synapses and represent promising alternatives to labor-intensive image analysis-based methods. By streamlining the analysis, these assays can contribute to a better understanding of the role of microglia in synaptic refinement in different disease models.

Autor im Rampenlicht: Förderung des Verständnisses durch technologische Innovationen in der Psychoneuroimmunologie

Here we present two protocols to quantify microglial engulfment of vGLUT1-positive synapses and pHRodo&#160;Red-labeled crude synaptosomes using flow cytometry.

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Quantifizierung der Mikroglia Morphologie von Mikrofotos von Immunohistochemistry vorbereitet Gewebe mit ImageJ

Zusammenfassung

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Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells

Ein Engulfment Assay: Ein Protokoll, um Interaktionen zwischen Fresszellen und Neuronen CNS bewerten

In Vivo Dynamics of Retinal Mikrogliaaktivierung Während Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoskopische Imaging and Cell Morphometrie in Maus Glaucoma

Zwei Algorithmen für den Hochdurchsatz und Multi-parametrischer Quantifizierung

Area-based Image Analysis Algorithm zur Quantifizierung von Makrophagen-Fibroblasten-Kokulturen

Analyse der Größe, Form und Direktionalität von Netzwerken von gekoppelten Astrozyten

Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie

Quantifizierung des mikroglialen Engulfments von synaptischem Material mittels Durchflusszytometrie