Diese Arbeit wurde von Neuro-Bio Ltd. finanziert. Wir möchten Dr. Giovanni Ferrati und Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) Danke für ihre Kommentare und Ratschläge auf dem Manuskript.

Unter anerkannten Protokolle wurden alle Tierversuche durchgeführt.
Hinweis: In diesem Abschnitt die Reihenfolge der wichtigsten Phasen durchgeführt während der Versuchsdurchführung und der vorgeschlagenen zeitlichen Abstand erfolgt (Abbildung 1). Darüber hinaus wird eine schrittweise Beschreibung des Protokolls ergänzt durch ein Bedienfeld "illustrative", mit kritischen Aktionen von Gehirnentfernung bis hin zu Gewebe Homogenisierung nach der Inkubationszeit (Abbildung 2). Die Details bezüglich der Materialien und die Anweisungen, um das Gerät und die nachfolgende Phase für die WB-Analyse zu bauen sind zuvor beschriebenen22.
(1) chirurgische Werkzeuge, Vibratome Einstellungen und Vorbereitung der Behandlung
Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte vor dem Start der Versuchsdurchführung:
<ol><li>Bereiten Sie zwei unterschiedlichen künstliche Liquor Flüssigkeiten (aCSFs), verwendet für das Schneiden von Gehirn und die andere für die inkubationsschritt29wie zuvor beschrieben. Kurz, die Arbeiten-Konzentrationen (in Mmol) von zwei aCSFs sind für die "schneiden" ACFS: 120 NaCl, 5 KCl, 20 Nahco33, 2,4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4und 10 Glukose; 6.7 HEPES Salz und 3,3 HEPES Säure; pH-Wert: 7,1. Während für die "Aufnahme" ACFS: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 Nahco33, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1,3 KH2PO4und 10 Glukose; pH-Wert: 7,1.</li>
	<li>Die Lösungen gut mischen und dann auf Eis gelegt und slicing ACFS um es Kälte beim Entfernen des Gehirns und das anschließende Schneiden mit Sauerstoff. Halten Sie Sie bei Raumtemperatur (RT) und Versorgungsmaterial Sauerstoff Aufnahme ACFS.</li>
	<li>Legen Sie die Instrumente unter der Dissektion Haube für die Enthauptung und Gehirn entfernen, d. h., Guillotine, chirurgischen Präparation Kit (Schere, Pinzette, Messer) und Spachtel.</li>
	<li>Richten Sie die Vibratome Parameter, indem er die Scheibendicke (300 µm in dieser Zubereitung) und die Häufigkeit von 7 und die Geschwindigkeit, mit 6. Legen Sie die Vibratome Kammer an der entsprechenden Stelle und mit Eis umgeben.</li>
	<li>Öffnen Sie das Carbogen (95 % O2, 5 % CO2) Ventil um das "Aufschneiden" (ACFS) während das Gehirn Schneiden mit Sauerstoff. Wählen Sie die minimale Durchflussmenge um 2 mL/min.</li>
	<li>Nehmen Sie zwei 15-mL-Röhren, die Bedingungen zu testen. Fügen Sie in eine Röhre 10 mL der "Aufnahme" ACFS allein (Kontrollgruppe) und in der anderen 10 mL der "Aufnahme" ACFS angereichert mit T30 in einer Konzentration von 2 µM (behandelten Gruppe). Vortex sowohl Rohre und halten sie auf dem Eis bis zu ihrer Verwendung in der Setup-Vorbereitungsphase (Abschnitt 3).</li>
</ol>(2) Anästhesie, Gehirn-Extraktion und schneiden
Hinweis: In dieser Studie wurden 9 Wildtyp P14 männliche Wistar-Ratten verwendet. Gehirn-Extraktion und anschließende schneiden dar einen wichtigen Bestandteil des Protokolls, da sie schnell (innerhalb von 10 min) erfolgen sollte, um zu verhindern oder zumindest verlangsamen Gewebe Degeneration Prozesse.
<ol><li>Fügen Sie 1,5 mL 100 % w/w von Isofluran auf einer baumwollschicht in die Induktion Kammer hinzu, legen Sie das Tier innen und schließen Sie den Deckel. Warten Sie, bis das Tier tief betäubt ist, bestätigt das Fehlen der Pedal-Reflex, und dann enthaupten Sie das Tier mit der Guillotine zu.</li>
	<li>Halten Sie den Kopf des Tieres in einen Topf mit eiskaltem schneiden ACFS im Gehirn Entfernung Schritt (Abbildung 2A -C).</li>
	<li>Einschneiden der Haut über den Schädel mit einem chirurgischen Klinge, dann schneiden Sie den Schädel mit einer Schere nach der Mittellinie aus dem hinteren Teil und fahren Sie körpertiefe bis zum Erreichen des Knochens über der OBs (Abbildung 2A).</li>
	<li>Ziehen Sie seitlich die beiden Seiten des Schädels mit einer Zange um Zugriff auf das Gehirn (Abb. 2 b) erhalten. Legen Sie einen Spachtel ventral zum Gehirn, schöpfen Sie sanft es aus, und halten Sie es im eiskalten "schneiden" ACFS für ca. 5 min (Abbildung 2) hydratisiert.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Gehirn auf Filterpapier und schneiden Sie das Kleinhirn mit einer Klinge (Abb. 2D). Kleben Sie das Gehirn vertikal auf der Vibratome CD und legen Sie sie in der speziellen Kammer, füllen Sie ihn mit eiskalten "schneiden" ACFS und liefern Sie Sauerstoff (Abb. 2E).</li>
	<li>Passen Sie es schneiden, und fahren Sie mit dem Gehirn-Schnitt (Abb. 2F). Sammeln Sie die Abschnitte mit der Region von Interesse, wie die medialen Scheidewand (MS), Diagonale Band von Broca (DBB) und Substantia Innominata (SI), wie zuvor beschrieben22. Von oben nach unten enthalten die drei Scheiben die rostral (R), Mittelstufe (I) und kaudalen (C) Teil der BF (Abbildung 2).</li>
	<li>Teilen Sie entlang der Mittellinie jeder Abschnitt mit einer kleinen Schere, erhalten zwei spiegelnde Hemislices (Abb. 2 H), einzeln als Kontrolle und behandelten Zustand bei der gleichen anatomischen Ebene verwendet.</li>
	<li>Halten Sie die Hemisections in der Vibratome Kammer für 5-10 min, dann mit einer Glaspipette in einem sprudelnden Topf mit Aufnahme ACFS überführen. Halten Sie bei RT für ca. 30 min zu erholen.</li>
	<li>Füllen Sie in der Zwischenzeit drei Glasfläschchen mit 3 mL Aufnahme ACFS allein (zuvor im Schritt 1.6 für die Kontrollgruppe bereit) und drei Fläschchen mit 3 mL ACFS angereichert mit T30 (zuvor im Schritt 1.6 bereit) für die behandelten Gruppe.</li>
</ol>3. Setup Vorbereitung
<ol><li>Die Hemisections in ihre entsprechenden Glasfläschchen (Abbildung 2I) zu übertragen, um drei aufeinander folgende Hemislices (einschließlich der rostral, zwischen- und kaudalen BF-Region) für die Kontrollgruppe (grüner Rahmen, Abbildung 2J) haben und deren passenden Partnern bei der behandelten Gruppe (roter Rahmen, Abbildung 2J).</li>
	<li>Übertragen Sie das Hirngewebe mit zwei verschiedenen Pinseln, eine für die Steuerung Hemislices und eine weitere für die behandelten Gegenstücke, um eine Kontamination zwischen Bedingungen zu verhindern.</li>
	<li>Jede Glasflasche mit dem entsprechenden Deckel, präsentieren die Sauerstoff Nadel (21G) (Abb. 2J) zu versiegeln. Verbinden Sie das Hauptrohr des Apparates mit Carbogen Quelle (Abbildung 2 K). Sauerstoff für die Hemislices während der Inkubationszeit mit einer minimalen Flussrate von 2 mL/min zu liefern, um jede Bewegung des Hirngewebes und mechanische Beschädigungen während des Versuchs zu vermeiden. Starten Sie die 5 h Inkubation. Führen Sie die Schritte 3.1-3.3 innerhalb von 5 Minuten. Hinweis: Prüfen Sie häufig (alle 15-20 min) ob der Sauerstoff in die Fläschchen versorgt wird und seinen Fluss nicht das Gewebe von unten bewegt.</li>
</ol>4. Probe Homogenisierung
<ol><li>Nach der Inkubation stoppen Sie der Sauerstoffzufuhr zu und entfernen Sie den Deckel aus dem Fläschchen. Übertragen Sie die Hemislices, mit der richtigen Bürsten, in 1,5 mL Röhrchen mit 250 µL Lyse Puffer, Aufrechterhaltung der Rohre auf dem Eis (Abbildung 2 L). Machen die Lyse Puffern, mischen PBS 1 X mit Phosphatase und Protease-Hemmer Cocktails sowohl 1: 100 verdünnt und Homogenisieren des Gewebes mit verschiedenen Stößel, Kontamination zwischen den Proben zu verhindern. Füllen Sie diese Aktionen innerhalb von 10-15 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Gehirn lysate bei 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C. Transfer des Überstands in neue Schläuche und halten die Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>5. Lesen der Proteinkonzentration und Western-Blot Analyse
<ol><li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe zu und anschließend bereiten Sie die Aliquote der Western-Blot Analyse als zuvor beschriebenen22 vor.</li>
	<li>Führen Sie statistische Analyse, um die Bewertung der Auswirkungen der Behandlung auf Protein-Expression.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären konkurrierende finanzielle Interessen. Susan A. Greenfield ist der Gründer und Präsident der Neuro-Bio-Limited, ein privat geführtes Unternehmen und hält Anteile an der Gesellschaft. Emanuele Brai und Antonella Cogoni sind Mitarbeiter von Neuro-Bio Ltd.

Der wichtigste Aspekt dieses Protokolls, basiert auf der bewährten ex Vivo -Gehirn-Technik ermöglicht zwei spiegelnde Hemislices, gewonnen aus der gleichen anatomischen Ebene, Überwachung ihrer Reaktion nach der Anwendung eines bestimmten synchron zu testen Zustand (Steuern oder behandelt); Dies bietet daher eine experimentellere Paradigma so streng kontrolliert wie möglich. Die Möglichkeit der Bewertung in einer Zeit, Dosis und ortsspezifische Weise verschiedene Neurochemikalien, die im Zusammenhang mit neuronalen Beeinträchtigung wie bei neurodegenerativen Veranstaltungen22, stellt ein wesentliches Merkmal. Diese Methode verbindet die Vorteile einer in Vivo physiologische Umgebung mit denen von in-vitro- Präparate, wie Genauigkeit bei der Beschaffung des Interessenbereichs und schaffen den idealen Rahmen der extrazellulären. Dieses Protokoll stellt eine Anpassung des gemeinsamen Gehirns schneiden Verfahren am meisten benutzt für ex-Vivo elektrophysiologische Aufnahmen25,26,27 und optische Bildgebung28, 29,30, oder in Vitro organotypischen Slices, die eine engere in-Vivo -Situation zu simulieren, indem Sie ermöglichen die Erhaltung der beiden Struktur- und synaptischen Organisation23,24 ,31,32.
Darüber hinaus ist dieses Verfahren könnte dazu beitragen, verringern Sie die Anzahl der Tiere in Verhaltensstudien verwendet, da es teilweise eine in Vivorepliziert-wie Zustand, die übernommen werden können, um in-vitro- Daten, z. B. Zellkultur zu bestätigen und immunhistochemische Analysen, und dann in Vivo Experimente zu antizipieren.
Die vorgeschlagene Methode stellt auch einige Einschränkungen, z. B. die Schnittdicke und Integrität, die gegebenenfalls nicht das endgültige Ergebnis verändern kann. Die Inkubationszeit ist auch ein wesentlicher Bestandteil dieser Technik, da es den Vergleich zwischen der Kontrollgruppe und der behandelten beeinflussen könnten. Darüber hinaus kann eine Reihe von Verfahren oder technische Probleme bei allen Arbeitsschritten des Protokolls, wie angetroffen werden: (1) mechanische Beschädigung beim Extrahieren oder schneiden das Gehirn, die vermieden werden, indem präzise und schonende Behandlung des Gewebes; (2) schweben von der Hemislices während der Inkubation durch eine übermäßige Sauerstoffzufuhr, die mechanisch das Gewebe schädigen können, wenn es die Sauerstoff Nadel berührt untergetaucht in der ACFS, was sich auf seine Integrität. Dies kann durch Anpassung an den Mindestsatz der Blasenbildung verhindert werden; und (3) fehlen oder ungleichmäßige Sauerstoffzufuhr, die können an den leeren Kanister, eine Beschädigung oder Trennung in das Schlauchsystem, ein Plug-in die Sauerstoff Nadel bezogen werden oder wenn es nicht ordnungsgemäß inmitten der ACFS. Da die Konstante Sauerstoffzufuhr und seinen Fluss während des Verfahrens stellt eines der wichtigsten Aspekte dieses Protokolls, ist es wichtig, alle diese Parameter, um einen homogenen Zustand zwischen den untersuchten Gruppen zu erhalten häufig zu beobachten.
Andere wichtige Schritte im Protokoll sind vertreten durch die Zeitfenster erforderlich, um jede Aktion ausführen, die bei gefolgt wird so viel wie möglich die Integrität und Funktionalität des Gewebes zu erhalten. Um diese Parameter zu beurteilen, kann darüber hinaus immunhistochemische Analysen durchgeführt werden, um spezifische Marker, die im Zusammenhang mit neuronalen Lebensfähigkeit und elektrophysiologische Aufnahmen als zuvor beschriebenen23,29erkennen.
Neben den hier dargestellten Ergebnissen könnte diese Methode entworfen ad hoc für bestimmte Untersuchungen sein. Zum Beispiel kann es zu angewendet werden: (1) Monitor und vergleichen die Aktivität verschiedener Verbindungen in mehreren des Gehirns Bereichen Brüten sie mit der gewählten Lösung, z. B. ACFS oder Neurobasal Medium; (2) führen Sie Untersuchungen auf Hypoxie, da die Sauerstoffzufuhr in jeder Hemisektion selektiv gesteuert werden kann; (3) Gehirn Gewebeeigenschaften von transgenen Tiermodellen von verschiedenen Krankheiten zu untersuchen; (4) gleichzeitig zu erkunden Sie, auf der gleichen anatomischen Ebene die Auswirkungen der in Vivo einseitige Gehirn-Injektionen und vergleichen Sie sie mit der Kontrolle Hemisphäre; und (5) andere Organe oder Gewebe Eigenschaften, daher potenziell erleichtern und Verkürzung der Drogen-screening-Studien zu erkunden.

AD ist eine chronische Krankheit gekennzeichnet durch allmähliche Neurodegenerative Beeinträchtigung beeinflussen verschiedene Hirnareale wie entorhinalen Kortex (EG), BF, Hippocampus (HC) und Riechkolben (OB)1,2,3, 4,5. Im Spätstadium der Entwicklung AD führen zu einem progressive kognitive Rückgang, so dass diese Erkrankung die häufigste Form der Demenz, entfallen etwa 70 % von allen Fällen6. Trotz umfangreicher Versuche zu verstehen, der Anfangsphase verursacht AD ist nicht derzeit eine definierte experimentelle Indikation Aufklärung sie. Darüber hinaus ist die populärste Theorie - "Amyloid-Hypothese" - zunehmend in Frage gestellt, da es nicht bietet ein vollständiges Profil in der Erklärung der AD Pathobiologie, noch eine pharmazeutische Ziel, die wirksame7,8 bewährt hat ,9.
Eine alternative Theorie, die zunehmend Beachtung deutet darauf hin, dass die anfängliche Mechanismen bei der Neurodegeneration zu einem neuronalen Cluster vor allem anfällig in AD3,10,11 zusammenhängen , 12 , 13 , 14. dieser heterogenen zellulären Hub umfasste innerhalb der BF, Mittelhirn und Hirnstamm, Projekte auf mehrere Regionen, wie z. B. die EG, HC und OB15,16. Trotz ihrer Vielfalt in neuronale Morphologie und Neurotransmitter-Synthese teilt diesen Kern der Zellen ein gemeinsames Merkmal im Ausdruck AChE, die auch ein nicht-enzymatische Funktion17,18haben kann. Diese nicht-klassischen Rolle als Roman Signaltechnik Molekül Kalzium (Ca2 +) fließen in Neuronen vermittelt die trophische oder toxische Ereignissen in Bezug auf Ca2 + Dosis, Verfügbarkeit und neuronale Alter17,18 unterzogen werden können , 19.
Während Neurodegeneration die beobachteten zelluläre Verlust daher möglicherweise mit diesem nicht-enzymatische Funktion17,18,20, was auf ein 30mer Peptid (T30) gespalten aus dem C-Terminus AChE zurückzuführen ist 20. im Einklang mit früheren Ergebnissen, geweitermacht Zellkultur und optische Bildgebung18,21 Vorbereitungen, wir unter Beweis gestellt, durch einen neuartigen Ansatz basierend auf ex Vivo Ratte Gehirnscheiben mit BF Strukturen, die induzierte T30 ein AD-ähnlichen Profil22. Insbesondere bietet diese neue Methodik ein physiologischer Szenario als Zellkultur, da es viele der Merkmale von einem intaktem Gewebe von anatomischen bis hin zu Schaltung Konservierung, wenn auch nur für ein Zeitfenster von Stunden unterhält. Wir angewendet dieses Protokoll zur Erkundung der Ereignisse in den frühen Phasen der Neurodegeneration, Überwachung der akuten Reaktion auf T30-Antrag.
Trotz der großen Körper der Literatur auf Gehirn Scheiben zu untersuchen molekulare Signalwege in neuronale Schäden impliziert oder Neurogenese23,24, dieses Protokoll bietet zum ersten Mal eine direktere und Sensitive ausgelesen im Vergleich für die gemeinsame Nutzung von organotypischen Scheiben. Jedoch wie der Fall für organotypischen Gehirn Abschnitte ist, kann dieser akuten Slice-Verfahren auch für verschiedene Zwecke, wie die Auswertung der neuroprotektive oder neurotoxische Moleküle, Entdeckung der primären molekulare Veränderungen in einem bestimmten Prozess angenommen werden, immunhistochemische Analysen und pharmakologischen Tests für zentrale Nervensystem im Zusammenhang mit Krankheiten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O))</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>63138</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>223506</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T30 peptide</td>
			<td>Genosphere Biotechnologies, France</td>
			<td></td>
			<td>AChE-derived peptide tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissecting kit</td>
			<td>World Precision Instruments, USA</td>
			<td>Item #: MOUSEKIT</td>
			<td>Brain removal step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades</td>
			<td>Swann-Morton, UK</td>
			<td>BS 2982</td>
			<td>Brain removal step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11566873</td>
			<td>Brain preparation for slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Brain preparation for slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td>Slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tissue handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen canister</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sectioning and incubation phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>BP2438-4</td>
			<td>Homogenization step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>1284-1650</td>
			<td>Homogenization step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche complete PIC, USA</td>
			<td>4693116001</td>
			<td>Homogenization step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>Starlab, UK</td>
			<td>I1415-5390</td>
			<td>Homogenization step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660 nm Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>22660</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative approach to study primary events in neurodegeneration using ex vivo rat brain slices

Trotz zahlreicher Studien, die versuchen, zuverlässige Tiermodellen zu entwickeln, welche reflektieren die primären zugrunde liegenden Neurodegeneration Prozesse, wurden nur sehr wenige weithin akzeptiert. Hier schlagen wir ein neues Verfahren aus der bekannten ex-Vivo Gehirn Stück Technik, die eine engere in Vivobietet angepasst-wie Szenario als in-vitro- Vorbereitungen für die Untersuchung der frühen Ereignisse auslösen Zelldegeneration, als bei der Alzheimer-Krankheit (AD) beobachtet. Diese Variante besteht aus einfachen und leicht reproduzierbar Schritten, die Erhaltung der anatomischen Cytoarchitecture der ausgewählten Hirnregion und seine lokalen Funktionalität in einem physiologischen Milieu zu ermöglichen. Verschiedene anatomische Bereiche erhalten Sie bei demselben Gehirn, bietet die Möglichkeit, mehrere Experimente mit den fraglichen Behandlungen in einer Website, Dosis und Zeit-abhängigen Weise durchführen. Mögliche Einschränkungen betreffen die Ergebnisse im Zusammenhang mit dieser Methodik beziehen sich auf die Erhaltung des Gewebes, d. h. die Aufrechterhaltung seiner anatomischen Integrität während der Schneiden und Inkubation Schritte und die Schnittdicke die die biochemische und immunhistochemische Analyse beeinflussen. Dieser Ansatz kann für verschiedene Zwecke, wie die Erforschung der molekularer Mechanismen in physiologische oder pathologische Bedingungen, Drogen-Screening oder Dosis-Wirkungs-Assays eingesetzt werden. Dieses Protokoll könnte schließlich auch die Zahl der Tiere in Verhaltensstudien beschäftigt reduzieren. Die Anwendung hier berichtet wurde vor kurzem beschrieben und zum ersten Mal auf ex-Vivo Ratte Gehirnscheiben mit basalen Vorderhirn (BF), eines der zerebralen AD in erster Linie betroffenen Regionen getestet. Insbesondere wurde nachgewiesen, dass die Verwaltung eines giftigen Peptids, abgeleitet aus dem C-Terminus der Acetylcholinesterase (AChE) eine AD-wie Profil, Auslösung, entlang der Antero-posterioren Achse der BF, eine differentielle Expression der veranlassen könnte Proteine verändert n. Chr., wie z. B. den alpha7 Nikotin-Rezeptor (α7-nAChR) phosphoryliert Tau (p-Tau) und Beta-Amyloid (Aβ).

Die hier vorgestellten Protokoll zeigt an, dass die Verwaltung eines giftigen Peptids, T30, in eine Website-abhängigen Weise die Expression von α7-nAChR, p moduliert-Tau und Aβ in BF-haltigen Abschnitten (Abb. 3A). Der Nikotin-Rezeptor zeigt eine deutliche Steigerung in der rostral behandelt Hemislice im Vergleich zu seiner Kontrolle Gegenstück (Scheibe 1, p = 0.0310) (Abb. 3 b), während die mittlere Scheibe Änderungen zwischen den zwei Bedingungen (nicht offenbaren Scheibe 2, p = 0.1195) (Abb. 3 b). Im hinteren Bereich eine deutliche Reduzierung ist in den T30-exponierten Teil über die Steuerseite (Scheibe 3, p = 0.0476) (Abb. 3 b). Auf Antrag der T30, p-Tau sind deutlich erhöht im Frontzahnbereich gegen die Kontrolle, die passende Seite (Scheibe 1, p = 0,0158) (Abbildung 3). Auf der anderen Seite die anderen zwei BF-haltigen Abschnitte zeigen keinen signifikanten Unterschied zwischen den Bedingungen (Scheibe 2, p = 0.1014; schneiden 3, p = 0.6405) (Abbildung 3). Nach der Belichtung T30 Aβ ist erheblich verbessert in die rostral und mittlere Hemisections im Vergleich zu ihren unbehandelten kontralateralen Portionen (Scheibe 1, p = 0.0136; schneiden 2, p = 0.0109) (Abbildung 3D). In dem kaudalen Segment gibt es keine Veränderung zwischen den beiden Behandlungen (Scheibe 3, p = 0.1231) (Abbildung 3D). Der primäre Antikörper gegen p-Tau erkennt das Epitop, enthält des phosphorylierten Ser202 Rückstands. Der primäre Antikörper gegen Aβ erkennt mehrere Isoformen, von Aβ37 bis hin zu Aβ42. Daten wurden analysiert, wie zuvor beschriebenen22 mit zwei gepaarten t tailed-tests und dargestellt als SEM. N = (Hemislices pro Gruppe, Ratten) ist (27, 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig1.jpg"> Abbildung 1: Sequenz und der vorläufige Zeitplan für die wichtigsten Schritte durchgeführt während der Versuchsdurchführung. Der zeitliche Abstand der ersten und dritten Schritts variieren in Bezug auf die Bedienerebene Erfahrung. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig2.jpg"> Abbildung 2: sequentielle Schritte illustriert das Protokoll Fortschreiten. (A–D) Extraktion des Gehirns aus dem Schädel und Trennung des Kleinhirns vom Rest des Gehirns. (E) Befestigung des Gehirns auf Vibratome Scheibe und Transfer in die Dissektion Kammer, die von Eis umgeben und gefüllt mit kaltem ACFS ständig Sauerstoff während dem Schneiden. (F) koronalen Gehirn schneiden. (G) Auflistung der Scheiben, mit rostral (R), Mittelstufe (ich) und kaudalen (C) Strukturen des basalen Vorderhirns. (H) Trennung der Abschnitte in zwei passenden Hemislices. (ich) jeder Hemisektion befindet sich in der entsprechenden Fläschchen. (J) Fläschchen in der Unterstützung, in der Geräte-Box positioniert und separat geschlossen. (K) Inkubation Zeitraum nach der Anbindung des Systems an die Sauerstoffquelle (Schwarzer Kreis). (L) Homogenisierung der Proben nach der Behandlung. Diese Zahl wird von22geändert. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig3.jpg"> Abbildung 3: T30 vermittelte standortspezifisch Ausdruck α7-nAChR, p-Tau und Aβ Rostro-kaudalen Achse BF. (A) Darstellung der koronalen Gehirnscheiben einschließlich der basalen Vorderhirn Kerne (weiße gepunktete Linien), aufgeteilt in zwei komplementäre Portionen und unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt. (B) nach T30 Belichtung der Nikotin-Rezeptor zeigt eine deutliche Steigerung in der vorderen Unterteilung (T30-1) und eine deutliche Reduktion der hintere (T30 3) im Vergleich zu den entsprechenden Kontrolle Seiten (STRG 1 und STRG-Taste 3). Die mittlere Scheibe zeigt keine Änderungen zwischen den zwei Bedingungen (Ctrl 2, T30-2). (C) p-Tau Ausdruck ist deutlich höher in den behandelten rostral Teil (T30-1) über seine Kontrolle passende Gegenstück (STRG 1), während die anderen beiden Scheiben nicht keinen Unterschied in den beiden Gruppen (Scheibe 2 und Scheibe 3) enthüllen. (D) Aβ zeigt eine deutliche Steigerung in der vorderen und mittleren behandelten Unterteilungen (T30-1 und T30-2) im Vergleich zu ihren entsprechenden unbehandelten Seiten (STRG-Taste 1 und 2 STRG). In den kaudalen Abschnitten gibt es keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die Fehlerbalken zeigen SEM. * p < 0.05.n = (Hemislices pro Gruppe, Ratten) ist (27, 9). Maßstab ist 1 mm. Diese Zahl wurde von22geändert. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Wir präsentieren eine Methode, die bieten weitere Einblicke in die frühe Ereignisse zugrunde liegenden Neurodegeneration und basiert auf der etablierten Ex-Vivo -Gehirn-Technik verbindet die Vorteile eines in Vivo und in Vitro Experimente. Darüber hinaus stellt es eine einzigartige Gelegenheit zum direkten Vergleich von behandelten und unbehandelten Gruppe in der gleichen anatomischen Ebene.

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

an-alternative-approach-to-study-primary-events-neurodegeneration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

6.8K Aufrufe.  Culham Science Centre. Wir präsentieren eine Methode, die bieten weitere Einblicke in die frühe Ereignisse zugrunde liegenden Neurodegeneration und basiert auf der etablierten Ex-Vivo -Gehirn-Technik verbindet die Vorteile eines in Vivo und in Vitro Experimente. Darüber hinaus stellt es eine einzigartige Gelegenheit zum direkten Vergleich von behandelten und unbehandelten Gruppe in der gleichen anatomischen Ebene.

Serie: An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Eine schnelle Annäherung an High-Resolution Fluoreszenz-Imaging in Semi-Thick Hirnschnitten

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, respectively 4,5,6,7 The GABAA channel is a pentameric GABA-gated chloride channel. The channel subunits are grouped into 8 families (&alpha;1-6, &beta;1-3, &gamma;1-3, &delta;, &#949;, &theta;, &pi; and &rho;). Two alphas, two betas and one 3rd subunit form the functional channel 8. By combining studies of sub-type specific GABA-activated single-channel molecules with studies including all populations of GABAA channels in the neuron it becomes possible to understand the basic mechanism of neuronal inhibition and how it is modulated by pharmacological agents.
We use the patch-clamp technique 9,10 to study the functional properties of the GABAA channels in alive neurons in hippocampal brain slices and record the single-channel and whole-cell currents. We further examine how the channels are affected by different GABA concentrations, other drugs and intra and extracellular factors. For detailed theoretical and practical description of the patch-clamp method please see The Single-Channel Recordings edited by B Sakman and E Neher 10.

We use the patch-clamp technique to measure GABA-activated single-channel currents (GABAA channels, GABAA receptors) and the synaptic and tonic currents they generate in neurons. Activation of the channels decreases neuronal excitability in health and disease 1,2,3,4.

GABA-aktivierten Single-Channel-und Tonic Currents in Hirnschnitten der Ratte

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Methoden zur Untersuchung der neuronalen Morphogenese:<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; RNAi Elektroporation in embryonale Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Maus-Hinterhirn<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur zu Gesichts Branchiomotor Neuron Migrationsstudie

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Ein<em&gt; Ex vivo</em&gt; Laser-induzierte Rückenmarksverletzungen Modell zu Mechanismen der axonalen Degeneration Beurteilen Sie in Echtzeit

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Schaltkreise in Hirnschnitten

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

In Vivo Functional Brain Imaging Ansatz, der auf Bioluminescent Calciumindikator GFP-Aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...