Wir danken P. Chu zur Durchführung von H & E und Histologie; und C. Wang und A. McCarty für hilfreiche Diskussionen. Forschung wurde unterstützt durch Mittel aus dem Virginia und D. K. Ludwig Fund for Cancer Research; das National Heart, Lung and Blood Institute (R01HL058770 und U01HL099999); und California Institute for Regenerative Medicine (RC1 00354) Zuschüsse für IW Y.R wurde unterstützt durch die Human Frontier Science Programm Career Development Award (CDA00017), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (RI 2787/1), Siebel Stem Cell Institute, und die Thomas und Stacey Siebel-Stiftung (1119368-104-GHBJI). J.M.T. wurde von der NIH (T32GM007365), der nationalen Forschung Service Award (1F30DK108561), und Paul und Daisy Soros Fellowship für neue Amerikaner unterstützt.

Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien, die von der Association for Assessment und Akkreditierung von Laboratory Animal Care International (AAALAC) und der Stanford University Verwaltungs-Panel am Versuchstier durchgeführt Pflege (APLAC), (Protokoll-Nummer #10266) und in den Vereinigten Staaten oder dem Europäischen Tierschutzgesetz Richtlinie 2010/63/EU. Das Protokoll wurde vom Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen des bayerischen Regierung, Deutschland, genehmigt und erhielt die Genehmigung nicht: 55.2-1-54-2532-150-2015.
(1) tierische Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie eine leere Käfig mit geeigneter Einstreu auf ein Heizkissen.</li>
	<li>Reiben Sie vor Tieren mit Handschuhen berühren die Mutter Bettzeug auf die Handschuhe.</li>
	<li>Entfernen Sie alle Welpen von ihrer Mutter und Ihrem Platz in den leeren Käfig. Entfernen Sie einige der mütterlichen Bettwäsche und legen Sie sie in den leeren Käfig mit den Welpen.</li>
	<li>Die Mutter in einem separaten, sauberen und trockenen Käfig entfernt das OP-Feld zu platzieren.</li>
	<li>Don neue, saubere sterile Handschuhe vor der Vorbereitung des Operationsfeldes.</li>
</ol>(2) op-Feld-Vorbereitung
<ol><li>Mit einer 10 mL-Pipette, 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Hinzufügen einer 10 cm Petrischale.</li>
	<li>Pipette 2 mL Betadine o.ä. antiseptisch-Lösung in der Petrischale 10cm.</li>
	<li>Legen Sie einen sezierenden Anwendungsbereich auf das Operationsfeld. Sezieren Umfang Lampe schalten Sie und passen Sie die Stufe des Lichts, der Chirurg Komfort. Ein Welpe kann in das OP-Feld unterhalb der sezierenden Umfang Lampe platziert werden. Ausreichend Licht kann durch das Fehlen von Schatten auf der ventralen Oberfläche der Pup bestätigt werden.</li>
	<li>Vorbereiten die Isofluran-Narkose-Kammer (siehe Tabelle der Materialien) mit einem Prüfkopf. Die Kammer sollte ohne Nachweis von Urin oder Kot gereinigt werden. Legen Sie die bugnase und damit verbundenen Schläuche sezierenden Rahmen im Operationsfeld. Die Strömung von Sauerstoff und Isofluran ausschließlich auf die bugnase abzulenken.</li>
	<li>Bereiten Sie einen postoperative Recovery-Bereich mit einem Heizkissen gesetzt bei etwa 37 ° C. Die postoperative Erholung sollte bestehen aus 4 Stück Gaze über das Heizkissen platziert. Wenn möglich, reiben Sie Gaze-Pads in der Mutters-Einstreu, Kot und Urin, die Mutter Duft zu bewahren. Hinweis: Es ist schlecht beraten, eine Wärmelampe verwenden, da dies es schwierig macht, die Temperatur zu kontrollieren. Erhöhte Temperaturen führt zu den Tod des Neugeborenen Mäusen.</li>
	<li>Vorbereiten und alle chirurgischen Instrumente mit einem Autoklaven sterilisieren. Die Werkzeuge sind erforderlich: Mikro-sezieren Schere, Mikro-sezieren Zange, Gaze, Gefäßklemme und 6-0 Monofile nicht resorbierbaren Naht. Chirurgische Instrumente können Resterilzed mit jedem Glas Bead Sterilisator.</li>
</ol>(3) teilweise Lobuläres Hepatektomie
<ol><li>Der Welpe zu betäuben, indem man sie in die bugnase auf seinen zurück und sanft taping, seine Füße und Hände im Ort. Der Welpe sollte 5 % Isofluran in Sauerstoff erhalten.<ol>
<li>Lassen Sie den Welpen zum Sitzen für 5 min oder bis ausreichend betäubt, die von einer Zehe kneiftest nachgeprüft werden kann.</li>
		<li>5 mg/kg Carprofen subkutan vor dem Schnitt zu injizieren. Hinweis: Die gesamte Operation dauert nicht mehr als 30 min. schlechtere Ergebnisse beim Neugeborenen beobachtet werden können, die unter Vollnarkose für über 30 min stehen. Vorkehrungen Sie zur Minimierung der Länge der Chirurgie durch gründliche Bereich Vorbereitung und Benetzung der Haut vor der Schließung, Naht induzierte Haut Tränen zu minimieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit einem kleinen Tupfer nass mit Betadine der hinteren Bauchwand reinigen Sie sanft. Lassen Sie Betadine 1 min trocknen.</li>
	<li>Machen Sie einen linken Mitte clavicular 0,5 cm Schnitt direkt unterhalb des Brustkorbs mit dem Mikro-sezieren Scheren und Pinzetten. Sanft die Haut mit einer Pinzette zu trennen und einen zweite tieferen Einschnitt in die Bauchhöhle (siehe Abbildung 1, Links und Mitte) machen</li>
	<li>Sanft seitlichen Druck von beiden Seiten des Bauches mit der Rückseite, die stumpfen Enden der Mikro-sezieren Scheren und Pinzetten, um die Spitze des linken Lappens aus der Bauchhöhle zu zwingen. Die linke Spitze des linken Lappens sollte leicht visualisiert (Abbildung 1, rechts).</li>
	<li>
Von der Spitze zu amputieren Sie und wiegen Sie die Menge des Gewebes entfernt werden.
	<ol>
<li>Mit der Mikro-Dissektion Schere, sanft amputieren Sie die gewünschte Menge des Gewebes von der Spitze des linken Lappens.</li>
		<li>Ort der amputierten Gewebe in ein 1,5-mL-Röhrchen gefüllt mit PBS. Die Amputierte Gewebe mit einer Analysenwaage wiegen (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Legen Sie ein Stück Gaze oder Papier auf die Waage und Tarieren sie. Dann platzieren Sie die Amputierte Gewebe Gaze oder Papier und Messen Sie seine Masse zu.</li>
		<li>Befestigen der amputierten Bereich in 2 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 1 h und Ort optimale Arbeitstemperatur (OCT) zusammengesetzte über Trockeneis für Gefrierschnitte Analyse. Gefrierschnitte abschnittsweise schneiden 7-10 µm mit jedem standard Kryostat zu analysieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Den linken Lappen mit einem gerollten Stück Gaze, sanft in die Bauchhöhle ersetzt werden. Verlassen Sie die Gaze in den Hohlraum, bis die Blutung aufhört.</li>
	<li>Entfernen Sie die Gaze und nass der Operationsstelle und Umgebung mit Gaze getränkt mit PBS.</li>
	<li>Schließen Sie die Operationsstelle mit 6-0 Monofile, nicht resorbierbare Nähte mit einem Running-Stich. Das Peritoneum und die Haut sollte separat geschlossen werden. Hinweis: Sanft Benetzung der Haut mit Gaze getränkt mit PBS kann Naht induzierte Tränen minimieren.</li>
	<li>Sanft aber gründlich reinigen Sie der Welpe mit Gaze getränkt mit PBS und gewährleisten Sie bleibt weder Blut noch Betadine zu. Roll das getränkte Gaze-Pad und sanft über die Wunde Zeichen sauber aus Blut oder Betadine scrub. Hinweis: Dies ist besonders wichtig, da die Mutter die Welpen Ausschlachten kann, wenn sie nur unzureichend gereinigt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie den Welpen aus die bugnase und legen Sie es auf die Recovery-Bereich, die enthält die Gaze-Pads, Kot und Urin der Mutters ausgesetzt. Sobald der Welpe erholt, ersetzen Sie der Welpe in den leeren Käfig durch die Mutter Bettzeug. Hinweis: Verwenden Sie keiner Wärmelampe. Die Verwendung einer Wärmelampe kann das Neugeborene zu einer Überhitzung führen.</li>
	<li>Wiederholen Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl der Welpen. Obwohl alle Welpen verwendet werden können, ist es im Allgemeinen ratsam, ein paar Welpen nicht operiert, zusammen mit den operierten Welpen ersetzt werden zu lassen.</li>
	<li>Ersetzen Sie alle Welpen gleichzeitig mit ihrer Mutter Einstreu in der Mutter-Käfig.</li>
</ol>4. Erholung und Analyse
<ol><li>
Follow-up auf den Mäusen täglich.
	<ol>
<li>Überprüfen Sie, dass die Wunde geschlossen ist und entfernen Sie Toten Welpen zu, falls vorhanden.</li>
		<li>Wenn die Wunde wieder öffnet, bereiten Sie die op Website und Erholung-Bereich als zuvor beschrieben, und wiederholen Sie Schritte 3,8 bis 3.12.</li>
		<li>5 mg/kg Carpofen subkutan 24 und 48 h nach dem Eingriff zu injizieren.</li>
		<li>Welpen für 56 Tage oder länger zu folgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Tiere nach der gewünschten Menge an postoperativen Tagen durch Kohlendioxid (CO2) Belichtung und zervikale Dislokation einschläfern.<ol>
<li>Platzieren Sie Mäuse in der Induktion / Euthanasie Kammer und schalten Sie die CO2 bis Mäuse aufhören zu atmen.</li>
		<li>Euthanasie durch zervikale Dislokation zu gewährleisten. Auf der dorsalen Hals der Maus mit der Vordergrund-Finger und Daumen nach unten drücken Sie und mit der anderen Hand ziehen Sie am Heck.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entfernen Sie die gesamte Leber en bloc und wiegen Sie es.
	<ol>
<li>Sorgfältig trennen Sie jeder Lappen und wiegen Sie getrennt. Hinweis: Entfernen Sie die Leber durch sorgfältige Präparation der Zwerchfell und Leber und Portal Schiffe. Die Lappen voneinander zu trennen, jeder Lappen an den proximalen Anhang sorgfältig seziert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie den Umfang der Regeneration durch den Vergleich der Mass der amputierten linken Lappen, die Masse der gesamten Leber. Eine unverletzte linke Lappen ist etwa 30 % der gesamten Leber.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben keine Angaben.

Akute Leberschädigung ist traditionell mit chemischen (Paracetamol, Ethanol, Carbon Titantetrachlorid) oder chirurgische Modelle (70 % partielle Hepatektomie) untersucht worden. Die regenerative Antwort nach 70 % teilweise Hepatektomie charakterisiert worden ist, um globale Hepatozyten Hypertrophie und mehrfache Umläufe der Zellteilung4,5einzubinden. Um Blutungen zu stoppen, ist dieses Modell jedoch begrenzt, da die großen Schiffe verlassen eine abnorme Umgebu...

Die Fähigkeit zur Regeneration eines Organs oder zur Wiederherstellung von Form und Funktion, ist gedacht worden, vor allem über die evolutionäre Zeit verloren. Das regenerative Potential der Erwachsenen Säugetier-Leber nach chemischen oder physikalischen akutverletzung wurde gefunden, um die Mobilisierung der alle verbleibenden Hepatozyten in Wellen von Hypertrophie und einige Runden der Zellteilung, wodurch eine funktionale aber was beinhalten architektonisch verschiedenen Orgel1,2,3,4,5. Vor kurzem, haben Studien begonnen, die regenerative Reaktion des Neugeborenen Säugetieren Organe auf eine Verletzung innerhalb der ersten Woche des Lebens6,7,8charakterisieren. Diese Studien haben gezeigt, dass wenn bei Neugeborenen Entwicklung verletzt, bestimmte Säugetiere Organe mit morphologischen Regeneration statt kompensatorische Wachstum oder Fibrose7,8 reagieren.
Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Regeneration der globalen Struktur und Funktion während der frühen neonatalen Periode6,7,8auftritt. Etablierten Leberschädigung Protokolle beinhalten chemische Verletzungen oder Verwaltung von Ethanol9,10,11, Paracetamol12,13,14,15 , Carbon Titantetrachlorid16,17,18,19, 70 % teilweise Hepatektomie4,20,21oder Entfernung der linken und mittlere Lappen. Chemische Verwaltung führt zum Zelltod Hepatozyten, aber oft Mikro und Makro-Strukturen intakt. Morphologische Regeneration kann nicht ohne weiteres in diesem Zusammenhang untersucht werden, wie die insgesamt hepatische Architektur nicht ausgelöscht wurde. Die 70 % teilweise Hepatektomie beinhaltet Naht Ligatur der großen Gefäße, die Blutung zu stoppen notwendig ist, sondern lässt eine nicht-physiologischen Umgebung mit ständigen Unterbrechungen des Gefäßsystems. Darüber hinaus ist nur mit dieser Methode auf Erwachsene Nagetiere, und ihre Anwendung auf das Neugeborene ist technisch äußerst schwierig. In diesem Sinne haben wir eine Methode, die in dem 20-30 % von der Spitze des linken Lappens, in einer Neugeborenen Maus P0 entfernt wird entwickelt (Abbildung 1A-1 b). Diese Methode ist chirurgisch konservative, minimal-invasive, nicht technisch anspruchsvoll und führt zum Verlust der Morphologie ohne die Unterbindung des Gefäßsystems, lässt Raum für Regeneration auftreten Brutto. Das resultierende Schritt für Schritt-Protokoll, wie unten beschrieben, ermöglicht für jeden Forscher eine partielle Lobuläres Hepatektomie an Neugeborenen Mäusen durchführen, um Säugetiere neonatale Regeneration in den frühen Stadien des postnatalen Lebens zu studieren. Diese Methode hat auch klare Anwendungen zu vergleichende Studien in der regenerativen Medizin und Stammzellbiologie, wie es in späteren Phasen des Lebens in der Leber verwendet werden kann.
Die häufigste akute Leberschädigung Studien sind chemisch induzierten Schäden, adult Leber Amputation oder 70 % teilweise Hepatektomie. Chemische Schäden oft intravenös, intraperitoneal oder orale Verabreichung von Paracetamol, Carbon Titantetrachlorid oder Ethanol beinhaltet, und ist eine relativ einfache und nicht-invasive Verletzung Modell. Wie bereits diskutiert, chemische Schäden Ergebnisse in Hepatozyten Zelltod, aber oft Blätter Stroma und Parenchym Strukturen intakt, macht es schwierig, Aussagen über morphologische Regeneration machen. Chemische Schäden oft konzentriert sich auf die hepatische Schiffe, so dass es eine nützliche Technik, Website und zellspezifische Verletzungen, studieren aber auch erschwert, kann weiter von Schiffen liegen und das mag, Ebene der gesamten Organs, anderen Populationen zu befragen, zur Regeneration beitragen. Trotz dieser Einschränkungen bleibt chemische Schäden noch eine nützliche und sehr physiologisch relevanten Verletzungen-Modell.
Erwachsene 70 % teilweise Hepatektomie beinhaltet die Entfernung der linken und mittleren Lappen nach Ligatur der hepatischen Gefäßsystem. Die Antwort auf Hepatektomie hat gut charakterisiert: die amputierten Leber 14 Tage Post 70 % teilweise Hepatektomie eine grob Architektur von derjenigen der ursprünglichen unbeschädigt Lappen als die Hepatozyten der verbleibenden rechten und caudatus Lappen entwickelt Hypertrophie und ein paar Runden der Zellteilung4,5zu unterziehen. Dies macht verloren und Funktion, aber schlägt fehl, die beiden amputierten Lappen zu regenerieren und ist daher kein Ersatz für grobe Morphologie. Dadurch eignet sich der Verletzung auf 70 % teilweise Hepatektomie, kompensatorischen Wachstum Mechanismen mit begrenzten Regeneration zu studieren.
Hier beschreiben wir voll und ganz ein Protokoll für eine neonatale teilweise Lobuläres Hepatektomie. Das Verfahren beinhaltet geeignete tierische Auswahl und Vorbereitung, Vorbereitung des Operationsfeldes, Chirurgie und Wiederherstellung. Optimierung und Anpassung der einzelnen Schritte können für verschiedene Anwendungen des Protokolls erforderlich.
Wir haben ausgiebig durchgeführt und optimiert dieses Protokoll auf Wildtyp C57BL/6J Welpen (JAX 000664), jedoch um unterschiedliche Zellpopulationen und Mechanismen der Regeneration zu untersuchen, wir auch verschiedene Transgene Tiere einschließlich Mäuse beherbergen verschiedene Cre verwendet und CreERT2 transgene und/oder Knock-ins (JAXAxin2CreERT2 018867, und Sox9CreERT2 JAX 018829) in Kombination mit fluoreszierenden Reporter, wie der Regenbogen und mTmG Systeme (R26VT2/GK3, R26 mT/mG) 22 , 23. fanden wir keine Notwendigkeit, diese Methode für verschiedene Mausstämme ändern, da keine Unterschiede im Überleben Ergebnisse oder regenerative Potenzial beobachtet wurden.
Neben der Verwendung von verschiedener tierischer Stämmen, führten wir auch teilweise lobulären Hepatectomies an Neugeborenen Mäusen mit kleinen Molekülen, wie 4-hydroxy-Tamoxifen und 5-Ethynyl-2 '-Deoxyuridine (EdU) behandelt. Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und Ethanol dienten als Lösungsmittel, da festgestellt wurde, dass Mais-Öl war eine wesentliche Ursache für Morbidität. Ansonsten fanden wir, dass intraperitonealer Verabreichung von kleinen Molekülen nicht überleben oder regenerative Ergebnisse beeinflussen. Wir sagen voraus, dass dieses Protokoll für die Verwendung mit anderen kleinen Molekülen zu verschiedenen Aspekten der Regeneration zu verhören angepasst werden.
Neugeborenen Maus Operationen können technisch anspruchsvoll und erfordern spezielles Know-how im Umgang mit Tieren und mikroskopische Dissektion. Tierhaltung-Kompetenz gilt, mütterliche Kannibalismus zu vermeiden nach der Operation und während der sofortigen Wiederaufnahme Periode.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mother with litter of day 0 neonatal pups (any strain)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surrogate mother and surrogate litter (optional)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Serum (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Providine-iodine or equivalent antiseptic solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3mm straight spring micro scissors</td>
			<td>Vannas</td>
			<td>72932-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5SF Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Kelly forceps</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>17-050G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td>000771-810-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Abbott Labs</td>
			<td>0044-5260-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Anesthesia System</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>1205S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze, 10.16 x 10.16cm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5ml microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 monocryl sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>MCP489G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S35839</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Aid, Plain, 110V</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>4-000-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mettler Toledo NewClassic ME Analytical Balances</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-912-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Cost Induction Chamber</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SOMNO-0730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

partial lobular hepatectomy: a surgical model for morphologic liver regeneration

Morphologische Organregeneration nach akuten Gewebeverlust ist häufig bei niedrigeren Wirbeltiere, aber wird selten in Säugetieren postnatale Leben beobachtet. Erwachsenen Leberregeneration nach 70 % teilweise Hepatektomie führt in Hepatozyten Hypertrophie mit einigen Replikation im verbleibenden Lappen mit Wiederherstellung der Stoffwechselaktivität, aber mit dauerhaften Verlust des verletzten Lappens Morphologie und Architektur. Hier zeigen wir eine neue Operationsmethode in der Neugeborenen, die eine physiologische Umgebung förderlich für die Regeneration lässt. Dieses Modell beinhaltet Amputation der linke Lappen Spitze und eine anschließende konservative Verwaltung Regime, und fehlt die Notwendigkeit einer Ligatur der großen Leber Gefäße oder chemischen Verletzungen, so dass eine physiologische Umgebung wo Regeneration stattfinden kann. Wir erweitern dieses Protokoll zu Amputationen an juvenilen (P7-14) Mäusen, bei denen die Geschädigte Leber von Organregeneration in kompensatorischen Wachstum durch Hypertrophie wechselt. Das präsentiert, kurz 30 min-Protokoll sieht einen Rahmen um die Mechanismen der Regeneration, der altersassoziierten Rückgang bei Säugetieren und die Charakterisierung der vermeintlichen hepatische Stiel oder Vorfahren zu studieren.

Abbildung 1A beschreibt eine allgemeine Chronologie der Neugeborenen teilweise Lobuläres Hepatektomie (schematisch in Abbildung 1 b) und die voraussichtliche Zeitdauer zu warten, bis die Regeneration beobachtet wird. Subtile Regeneration der linke Lappen kann beobachteten 7-14 Tage Post op. Volle Regeneration wurde oft beobachtet, nach 56 Tagen-Chirurgie Post. Mäuse sollten keine Anzeichen von physiologischen Auffälligkeiten n...

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Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Partielle Lobuläres Hepatektomie: Chirurgische Modell für morphologische Leberregeneration

Hier präsentieren wir eine neue Methode zur teilweisen Resektion des linken hepatischen Lappens bei Neugeborenen (Tag 0) Mäusen. Dieses neue Protokoll eignet sich für akute Leberschädigung und Verletzungen Reaktion in der neonatalen Einstellung zu studieren.

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

partial-lobular-hepatectomy-surgical-model-for-morphologic-liver

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.0K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine. Hier präsentieren wir eine neue Methode zur teilweisen Resektion des linken hepatischen Lappens bei Neugeborenen (Tag 0) Mäusen. Dieses neue Protokoll eignet sich für akute Leberschädigung und Verletzungen Reaktion in der neonatalen Einstellung zu studieren.

Serie: Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

The objective of this report is to describe the protocols to derive the retinal pigment epithelium (RPE) from induced pluripotent stem (iPS) cells using different sizes of embryoid bodies.

Ableiten Retinapigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von verschiedenen Größen von Embryoidkörpern

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.

Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Isolierung von Maus Endometrial Epithelial und Stromazellen für<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Chirurgische Ablation Assay zur Untersuchung von Augen Regeneration in Planarien

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Eine vereinfachte und effiziente Methode zur primären menschlichen Keratinozyten aus Erwachsenen Hautgewebe zu isolieren

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...