Wir danken für die Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts Clare Prendergast. Sicherheitsanweisungen wird unterstützt durch eine Forschung gewähren (#2095) von der Stiftung Flinn und TM wird unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01HL056643 und R01HL092514). Sicherheitsanweisungen der Methoden entwickelt, die Studie konzipiert und schrieb das Manuskript; OM mit Tierversuchen und klinischen Probe Beschaffung unterstützt; SB mit durchflusszytometrischen Analyse und Zellsortierung unterstützt; TM die Studien überwacht und überprüft das Manuskript.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) und die institutionelle Review Board (IRB) am St.-Josephs Hospital und Medical Center genehmigt.
1. Isolierung des AMs aus murinen alvéolaire Lavage (BAL) Flüssigkeit
<ol><li>Betäuben Sie eine acht Wochen alten C57BL/6-Maus mit Ketamin (87,5 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (12,5 mg/kg Körpergewicht) über eine intraperitoneale Injektion cocktail. Gehen Sie bei Maus chirurgische Anästhesie mit Verlust von Reflexen und Entspannung der Muskulatur erreicht.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Dissektion-Oberfläche, mit der Bauchseite nach oben. Tragen Sie Augenheilkunde Tierarzt Salbe auf Augen zu verhindern Austrocknung und wischen die gesamte ventrale Oberfläche der Maus mit sterilen Prep Alkoholtupfer gesättigt mit 70 % Isopropanol zu desinfizieren.</li>
	<li>Montieren Sie die Maus mit allen vier Beinen zurückgehalten.</li>
	<li>Öffnen Sie sanft die Bauchhöhle mit Mikro Dissektion Werkzeuge. Vorsicht ist geboten, um so viel Raum wie möglich zu öffnen, ohne irgendwelche viszeralen Organe beschädigen oder überhängenden Gewebe zu schaffen.</li>
	<li>Sanft öffnen der Brusthöhle durch Eingrabung langsam den Brustkorb durch das Mediastinum. Im Idealfall können den Brustkorb von Seite zur Seite herausgeschnitten werden. Extreme Vorsicht ist geboten, um nicht zu verletzen die Pleura der Lunge während des Öffnens der Brusthöhle.</li>
	<li>Suchen Sie die minderwertige Vena Cava und einen Einschnitt, die Maus zu bluten. Verwenden Sie Watte-Pads, um Blut aufzusaugen.</li>
	<li>Injizieren Sie 10 mL eiskaltes Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Rechte Herzkammer (mit 10 mL Spritze und Nadel 25G) zum zirkulierenden Blutzellen zu spülen. Der Blutfluss mit Watte-Pads zu absorbieren. Einmal komplett durchblutet, die Lungen erscheint blanchiert und sind dann bereit für Lavage.</li>
	<li>Vorsichtig Aufschneiden der Haut und Muskel in den Hals, um die Atemwege zu entlarven. Verbrauchsteuern Sie sorgfältig die angrenzenden Muskeln, Knorpel und Fettgewebe ohne Beschädigung der Luftröhre.</li>
	<li>Machen Sie einen kleinen Schnitt (< 2 mm) auf die Luftröhre nach den Kehlkopf. Dieser Schnitt sollte gerade genug, um einen Katheter in einfügen, während die Luftröhre Kehlkopf noch angeschlossen ist. Legen Sie einen 1-Zoll-22G-Katheter ohne Nadel in die Luftröhre zur Lunge. Der Katheter mit einer Seide geflochtene Naht (4: 0; nicht absorbierbare) mit einem Kreuzknoten. Hinweis: Der Katheter muss getrimmt werden basierend auf der Größe der Maus. Extrem kurze oder lange Katheter tendenziell undicht und/oder reißen die Atemwege während Lavage. Katheter-Länge sollte so sein, dass bei vollständig eingesteckt bleibt die Spitze gut innerhalb der Luftröhre und erreichen nicht die primäre Bronchien.</li>
	<li>Befestigen Sie eine 1-mL-Spritze mit eiskalten BAL-Puffer (Ca2 + und Mg2 + kostenlose PBS + 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure, EDTA) des Katheters gefüllt und vermitteln Sie langsam den Puffer in die Lunge zu. Dies wird die Lungen aufzublasen. Halten Sie die Spritze befestigt am Katheter für fünf Sekunden und Aspirieren Sie die Lavage-Flüssigkeit durch leichtes Ziehen des Kolbens. Dies wird Luft aus der Lunge. Sammeln Sie die Flüssigkeit in einem 15 mL konische Röhrchen auf Eis gelegt.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 1.10 für neun weitere Male und bündeln Sie die Lavage-Flüssigkeit. Überschreiten Sie 1 mL Puffer pro Spülung, nicht, da das Überschreiten der Lungenkapazität und zu seinen Bruch führen kann.</li>
	<li>Die Maus mit CO2 Überdosierung durch IACUC genehmigte Protokoll einschläfern.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die 10 mL BAL-Flüssigkeit bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten. Die Zelle Pellet enthält BAL Zellen. Vorsicht: Das Pellet kann sehr klein sein, also seien Sie vorsichtig, wenn den überstand absaugen.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie BAL Zellen in 100 μL der Strömung/Sortierung Puffer (PBS + 2 % Hitze inaktiviert fetalen bovine Serum (FBS) + 1 mM EDTA + 25 mM N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic Säure (HEPES)).</li>
	<li>Die unspezifische Antikörperbindung an Fc-Rezeptor zu blockieren, indem hinzufügen Maus Fc-Block (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) und Inkubation für 20 Minuten auf Eis.</li>
	<li>Führen Sie Antikörper Färbung zusammen mit Fluoreszenz minus eins (FMO) und Single-Fleck steuert11,25. Bewerten die BAL Zellen eine Zelle Analyzer (siehe Tabelle der Materialien) gefolgt von einzelligen Flow Cytometry-Analyse von geeigneten Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>AMs isolieren von einer Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sorter (siehe Tabelle der Materialien) direkt in 1 mL Maus bin Kulturmedium beim AMs für Kultur in Vitro oder in Vivo bestimmt sind Zelle übertragen. Alternativ (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt Art AMs in 1 mL Lyse-Puffer mit 10 μL/mL β-Mercaptoethanol für RNA-Extraktion.</li>
</ol>2. Isolierung des AMs von Maus-Lunge, Single-Zellsuspension
<ol><li>Betäuben Sie eine acht Wochen alten C57BL/6-Maus mit Ketamin (87,5 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (12,5 mg/kg Körpergewicht) über eine intraperitoneale Injektion cocktail. Gehen Sie bei Maus chirurgische Anästhesie mit Verlust von Reflexen und Entspannung der Muskulatur erreicht.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf eine Dissektion-Oberfläche, mit der Bauchseite nach oben. Tragen Sie Augenheilkunde Tierarzt Salbe auf Augen zu verhindern Austrocknung und wischen die gesamte ventrale Oberfläche der Maus mit sterilen Alkoholtupfer gesättigt mit 70 % Isopropanol zu desinfizieren.</li>
	<li>Montieren Sie die Maus mit allen vier Beinen zurückgehalten.</li>
	<li>Öffnen Sie sanft die Bauchhöhle mit Mikro Dissektion Werkzeuge. Vorsicht ist geboten, um so viel Raum wie möglich zu öffnen, ohne irgendwelche viszeralen Organe beschädigen oder überhängenden Gewebe zu schaffen.</li>
	<li>Sanft öffnen der Brusthöhle durch Eingrabung langsam den Brustkorb durch das Mediastinum. Im Idealfall können den Brustkorb von Seite zur Seite herausgeschnitten werden. Extreme Vorsicht ist geboten, um nicht zu verletzen die Pleura der Lunge während des Öffnens der Brusthöhle.</li>
	<li>Suchen Sie die minderwertige Vena Cava und einen Einschnitt, die Maus zu bluten. Verwenden Sie Watte-Pads, um Blut aufzusaugen.</li>
	<li>Injizieren Sie 10 mL eiskaltem PBS in den rechten Ventrikel (mit 10 mL Spritze und Nadel 25G), um die zirkulierenden Blutzellen zu spülen. Einmal komplett durchblutet, die Lungen erscheint blanchiert und sind bereit für die Ernte.</li>
	<li>Aus der Lunge durch Abtrennen der Luftröhre, Blutgefäße und Bänder in ein 15 mL konische Röhrchen mit 5 mL kaltes sezieren Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM). Erst im nächsten Schritt auf Eis halten.</li>
	<li>Die Maus mit CO2 Überdosierung durch IACUC genehmigte Protokoll einschläfern.</li>
	<li>Übertragen Sie der PERFUNDIERTEN Lunge in einer Kulturschale sterile und Pyrogenfreie kostenlos 60 mm mit 3 mL DMEM. Herauszuarbeiten Sie mit Hilfe der Zange sezieren, die Atemwege und andere harte Lungengewebe Material, falls vorhanden. Zerkleinere das Lungengewebe mit einem Skalpell zu < 1 mm Größe.</li>
	<li>Hinzufügen von 300 µg/mL Liberase TL und 5 U/mL DNase I, mischen, indem Sie pipettieren und 25 Minuten bei 37° C in einem Inkubator inkubieren. Mischen Sie vorsichtig einmal durch pipettieren nach 10 Minuten.</li>
	<li>Ein 100 µm Zelle Sieb auf eine 50 mL konische Rohr installiert durchlaufen Sie die dissoziierten Lungen. Verwenden Sie die Rückseite von einem Kolben von 1 mL Spritze, mash up Zelle Klumpen auf dem Filter. Waschen Sie den Filter mit 20 mL Waschpuffer (PBS + 2 % Hitze inaktivierten FBS + 2 mM EDTA).</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 500 X g bei 4 ° C für 5 Minuten. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle-Pellets in 20 mL Waschpuffer.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.12 und 2.13 zweimal, Filter und Schlauch jedes Mal ändern. Pre-Einweichen des Filters in Waschpuffer für mehr als fünf Minuten erhöht die AM Ertrag. Bereiten Sie Einzel-Zellsuspension durch Zugabe von 100 μl Puffer, um die Zelle Pellet Fluss/Sortierung.</li>
	<li>Die unspezifische Antikörperbindung an den Fc-Rezeptor zu blockieren, indem hinzufügen Maus Fc-Block (Klon 2.4G2, 10 μg/mL) und Inkubation für 20 Minuten auf Eis.</li>
	<li>Führen Sie Antikörper Färbung sowie FMO und Single-Fleck Kontrollen11,25. Bewerten die Lunge Zellen eine Zelle Analyzer (siehe Tabelle der Materialien) gefolgt von einzelligen Durchflusszytometrie Analyse durch Analyse Software.</li>
	<li>Art-AMs durch einen Zelle Sorter (siehe Tabelle der Materialien) direkt in 1 mL Maus bin Kulturmedium beim AMs für Kultur in Vitro oder in Vivo bestimmt sind Zelle übertragen. Sortieren Sie alternativ AMs in 1 mL Lyse-Puffer mit 10 μL/mL β-Mercaptoethanol für RNA-Extraktion ergänzt.</li>
</ol>3. Isolierung des AMs aus menschlichen BAL-Flüssigkeit
<ol><li>Übertragung der menschlichen BAL-Flüssigkeit aus der Klinik an das Labor bei 4 ° c zu vereinbaren</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die BAL-Flüssigkeit (10-50 mL) bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten. Die Zelle Pellet enthält BAL Zellen11.</li>
	<li>Waschen Sie die Pellets mit 20 mL Waschpuffer (PBS + 2 % Hitze inaktivierten FBS + 2 mM EDTA) und Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.</li>
	<li>Aufschwemmen der BAL-Zellen in 100 μL sind der Strömung/Sortierung Puffer (PBS + 2 % Hitze inaktivierten FBS + 1 mM EDTA + 25 mM HEPES).</li>
	<li>Die unspezifische Antikörperbindung an den Fc-Rezeptor durch Hinzufügen von menschlichen Fc Block (Klon Fc1.3070, 25 μg/mL) und Inkubation für 20 Minuten auf dem Eis zu blockieren.</li>
	<li>Führen Sie Antikörper Färbung sowie FMO und Single-Fleck Kontrollen11,24. Bewerten die BAL Zellen eine Zelle Analyzer (siehe Tabelle der Materialien) gefolgt von einzelligen Durchflusszytometrie Analyse durch Analyse Software.</li>
	<li>Art-AMs durch einen Zelle Sorter (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt direkt in 1 mL menschlichen AM Kulturmedium oder 1 mL Lyse-Puffer mit 10 μL/mL β-Mercaptoethanol.</li>
</ol>4. in-vitro- Kultur von AMs
<ol><li>Im Anschluss an die Zellsortierung Ernten der Zellen durch Zentrifugieren bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie menschliche AMs in 1 mL menschlichen AM Kulturmedium [Roswell Park Memorial Institute mittlerer (RPMI) 1640 ergänzt mit 10 % FBS, 20 % 929 Kultur überstand (als eine Quelle von Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF), 100 U/mL Endkonzentration), 1 mM Natrium Pyruvat, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic Säure (HEPES) und 1 X Penicillin/Streptomycin (optional)]. In ähnlicher Weise Aufschwemmen Sie Maus AMs in 1 mL Maus AM Kulturmedium [DMEM mit 10 % FBS, 20 % 929 Kultur überstand (als Quelle für M-CSF, 100 U/mL Endkonzentration), 1 mM Natrium Pyruvat, 10 mM HEPES und 1 X Penicillin/Streptomycin (optional ergänzt )].</li>
	<li>Aufzählen der Trypan blau-lebensfähige Zellen durch einen Zelle Zähler und passen Sie die tragfähige Zellkonzentration auf 1 x 106/mL. Hinweis: Im Idealfall kann bis zu 5 x 105 AMs isoliert von BAL-Flüssigkeit, die aus einer 8-10 Wochen alte C57BL/6 männliche Maus gesammelt werden. AM Ertrag aus dem Maus-Lunge-Digest kann ist variabel und etwas weniger als die der Maus BAL-Flüssigkeit. AM Ertrag aus menschlichen BAL-Flüssigkeit hängt vom Volumen der BAL-Flüssigkeit, das Gesamtvolumen der Saline in der Lavage und klinischen Zustand des Patienten verwendet.</li>
	<li>Basierend auf den Ertrag und die experimentelle Notwendigkeit, Samen der Zellen in Kammer Folien, Kultur-Gerichte oder Kulturflaschen. Im Idealfall Samen Sie das AMs auf 1 x 10-5-/mL mit 10 mL Medium in einem T25 Gewebekultur Kolben.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator von 37 ° C mit 5 % CO2 Atmosphäre. Hinweis: AMs wird als adhärente Zellen wachsen und sind extrem langsamwüchsig (Verdopplungszeit > 7 Tage).</li>
	<li>24 Stunden nach Aussaat, AMs sollte sein Anhänger und wird nicht durch einen sanften Wechsel des Kulturmediums abgenommen werden. Entfernen Sie das Medium durch Absaugen von einem Ende und Auffüllen mit frischem Medium auf 37 ° c vorgewärmt Hinweis: Die Zellen können jetzt verwendet werden, AM Physiologie oder die Auswirkungen von Reizen zu beurteilen. AMs gewachsen in Kammer Folien können auch bequem mit entsprechenden Antikörpern gebeizt und sind ideal für mikroskopische Visualisierung. Für Flow durchflusszytometrischen Bewertung geerntet AMs durch Inkubation mit nicht-enzymatische Zelle abkoppelt Lösung.</li>
	<li>Das Kulturmedium abgesaugt und fügen Trennendem Lösung genug zur Abdeckung der Kultur (ca. 2 mL pro T25 Kolben) und ca. 5-10 Minuten bei 37 ° C inkubieren. Kein kratzen wird notwendig sein, und es wird nicht empfohlen, die Zellen mechanisch zu kratzen. Klopfen Sie leicht die Seiten, fügen Sie 1-2 mL Flow/Sortierung Puffer und pipette vorsichtig rauf und runter um die Mehrheit der adhärenten Zellen zu lösen.</li>
	<li>Für RNA-Studien lyse der Zellen in der Kulturschale direkt durch Zugabe von Lysis Puffer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Westphalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+alveolar+macrophages+communicate+with+alveolar+epithelium+to+modulate+immunity.">Sessile alveolar macrophages communicate with alveolar epithelium to modulate immunity.</a> Nature. 506 (7489), 503-506 (2014).</li><li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+develop+from+fetal+monocytes+that+differentiate+into+long-lived+cells+in+the+first+week+of+life+via+GM-CSF.">Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF.</a> J Exp Med. 210 (10), 1977-1992 (2013).</li><li>Cardani, A., Boulton, A., Kim, T. S., Braciale, T. 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A mechanism for the effective inhibition of pulmonary cell-mediated immunity.</a> Am J Pathol. 148 (2), 657-666 (1996).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+alveolar+macrophages+by+clodronate-liposomes+aggravates+ischemia-reperfusion+injury+of+the+lung.">Depletion of alveolar macrophages by clodronate-liposomes aggravates ischemia-reperfusion injury of the lung.</a> J Heart Lung Transplant. 24 (1), 38-45 (2005).</li><li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+essential+for+protection+from+respiratory+failure+and+associated+morbidity+following+influenza+virus+infection.">Alveolar macrophages are essential for protection from respiratory failure and associated morbidity following influenza virus infection.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004053 (2014).</li><li>Pribul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alveolar+macrophages+are+a+major+determinant+of+early+responses+to+viral+lung+infection+but+do+not+influence+subsequent+disease+development.">Alveolar macrophages are a major determinant of early responses to viral lung infection but do not influence subsequent disease development.</a> J Virol. 82 (9), 4441-4448 (2008).</li><li>Macdonald, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+alveolar+macrophages+for+sustained+mucosal+T-cell+recall+confers+long-term+protection+to+mice+against+lethal+influenza+challenge+without+clinical+disease.">Harnessing alveolar macrophages for sustained mucosal T-cell recall confers long-term protection to mice against lethal influenza challenge without clinical disease.</a> Mucosal Immunol. 7 (1), 89-100 (2014).</li><li>Benoit, A., Huang, Y., Proctor, J., Rowden, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+alveolar+macrophage+depletion+on+liposomal+vaccine+protection+against+respiratory+syncytial+virus+(RSV).">Effects of alveolar macrophage depletion on liposomal vaccine protection against respiratory syncytial virus (RSV).</a> Clin Exp Immunol. 145 (1), 147-154 (2006).</li><li>Nayak, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+persistence+of+donor+alveolar+macrophages+in+human+lung+transplant+recipients+that+influences+donor+specific+immune+responses.">Long-term persistence of donor alveolar macrophages in human lung transplant recipients that influences donor specific immune responses.</a> Am J Transplant. 16 (8), 2300-2311 (2016).</li><li>Sekine, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+passenger+leukocytes+in+allograft+rejection:+effect+of+depletion+of+donor+alveolar+macrophages+on+the+local+production+of+TNF-alpha,+T+helper+1/T+helper+2+cytokines,+IgG+subclasses,+and+pathology+in+a+rat+model+of+lung+transplantation.">Role of passenger leukocytes in allograft rejection: effect of depletion of donor alveolar macrophages on the local production of TNF-alpha, T helper 1/T helper 2 cytokines, IgG subclasses, and pathology in a rat model of lung transplantation.</a> J Immunol. 159 (8), 4084-4093 (1997).</li><li>Borie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+alveolar+proteinosis.">Pulmonary alveolar proteinosis.</a> Eur Respir Rev. 20 (120), 98-107 (2011).</li><li>Greenhill, S. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb7a+induction+in+alveolar+macrophages+is+implicated+in+anti-HLA-mediated+lung+allograft+rejection.">Zbtb7a induction in alveolar macrophages is implicated in anti-HLA-mediated lung allograft rejection.</a> Sci Transl Med. 9 (398), (2017).</li><li>Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+macrophages+and+dendritic+cell+subsets+in+the+mouse+lung.">Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (4), 503-510 (2013).</li><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood,+bronchoalveolar+lavage,+and+lung+tissues.">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

AMs sind langlebige Lunge ansässige Makrophagen, die die Lunge beginnt bei der Geburt und dauerhaft über die gesamte Lebensdauer26bevölkern. Ihre Rollen in pulmonalen Physiologie7 und Pathologie12 und ihr Potenzial zur pulmonalen Autoimmunität24 Vorhersagen wurden erkannt. Da AMs eine langfristige Präsenz in der Lunge11,27 haben und Aktivierung und Fortschreiten der Immunantworten11,24, ihre Rolle(n) in andere chronische entzündliche und fibrotische Lunge beteiligt sind Krankheiten müssen ausgewertet werden. Historisch, AMs hatte eine verwirrende Identität und wurden häufig misidentified. Mit kürzlich verabschiedeten phänotypische Markierungen25,28ist es jetzt möglich, Menschen zu unterscheiden und Maus AMs von anderen pulmonalen Fresszellen (z. B. interstitielle Makrophagen, pulmonale dendritischen Zellen und monocyte Pulmonale Makrophagen abgeleitet). Die hier beschriebenen Methoden sind für die Isolierung und für in-vitro- Kultur von Maus und Mensch AMs optimiert worden. Obwohl diese Protokolle im großen und ganzen für AMs artfremder angenommen werden können, sollten entsprechende phänotypischen Entschlossenheit durchgeführt werden, um "minimal erforderliche" oberflächenmarker für gründliche Charakterisierung festgelegt werden.
Zur Isolierung der murinen AMs durch Lavage Einbeziehung von chelatisierenden Agent (d.h., EDTA) und Pre-Kühlung des BAL-Puffers erwiesen sich in der aktuellen Studie wichtig. Da AMs sind Anhänger der alveolären Wand, Verwendung von PBS allein war wirkungslos in den Zellen verdrängen und erzeugt eine deutlich niedrigere Rendite. Sicherung der Installation des Katheters in die Luftröhre ist ein weiterer wichtiger Schritt. Darauf sollte geachtet werden, eine auslaufsichere Befestigung zu gewährleisten, die BAL Flüssigkeitsverlust minimiert. Besondere Vorsicht ist erforderlich beim Lavaging eine jüngere Maus (< 6 Wochen alt), da die strukturellen Zartheit der Luftröhre zu reißen oder Leckage während Lavage führen kann. Installation von zwei aufeinander folgenden nicht überlappenden Nähte oft sorgt für eine sichere Befestigung des Katheters und verhindert Lecks. Obwohl nicht-enzymatische Dissoziation (zB., mit einem Chelator ergänzt-Puffer) war nur AM Isolation in dieser Studie durchgeführt, ist es möglich, dass enzymatische Dissoziation mit Kollagenase während Lunge Lavage eine bessere Ausbeute AM produzieren kann.
Die Ausbeute an menschlichen AM BAL-Flüssigkeit ist variabel. AMs bilden fast 10 % aller BAL-Zellen aus menschlichen Lunge Transplantationspatienten Norton Brust-Institut während der Routine nach Lungentransplantation Weiterverfolgung gesammelt, und die Gesamtausbeute Uhr ist abhängig von mehreren Variablen. Solche Variablen umfassen klinische Zustand des Patienten, das Volumen der Saline in Lavage verwendet und das Volumen der BAL-Flüssigkeit AM Isolation verarbeitet. Pre-Lavage Verfahren (z. B. Nadel Biopsien), die zu Microhemorrhage führen verändern die zelluläre Zusammensetzung der BAL Zellen; Dennoch ermöglicht die Implementierung von phänotypischen Marker für eine eindeutige Erkennung und Charakterisierung von den menschlichen AM Pool (Abbildung 2).
Verwendung von 929 Klimaanlage Medium (eine Quelle von M-CSF) war notwendig für die in-vitro- Wartung des AMs. Es ist unsere Überzeugung, dass eine Supplementierung von gereinigtem M-CSF würde ausreichen, um nachhaltig das AMs in Kultur; Allerdings muss eine optimierte Konzentration ausgearbeitet werden für Mensch und Maus-AMs. Die kultivierten Zellen können für Studien über Endozytose, Reaktion auf Entzündungen, Antigenpräsentation, Reifung/Aktivierungsstatus oder anderen Assays, die Wartung von lebenden Zellen für ein Zeitverlauf Analyse11,24 erfordert verwendet . Im Rahmen dieser Studie, es wurde nicht versucht, AMs als eine ständig kultivierten Linie und terminal Kurzzeitstudien pflegen (< 30 Tage seit der Ernte) wurden durchgeführt. Daher ist eine offensichtliche Einschränkung dieser Methode Mangel eine Langzeitdaten Kultur, vor allem auf die Stabilität der Zellen (d. h. ob AMs wachsen können, als eine endliche oder kontinuierliche Linie, die Antwort von AMs auf Kryoprotektanten und Kryokonservierung, und phänotypischen und/oder genotypischen Drift) nach laufenden Kultur. AMs sind lang lebende Zellen in vivo und ein gewisses Maß an Variation zwischen den Zellen isoliert von gesunde Lungen und von denen eine Infektion der Atemwege oder entzündliche/autoimmune Antworten erwartet.
Alles in allem, die Methode hier vorgestellten Dokumente einen vereinfachten Ansatz zur Isolierung, Charakterisierung, und menschliche Pflege und Maus AMs in einem Zellkultursystem. Obwohl dieses Protokoll weiter optimiert werden kann, je nach Bedarf experimentelle kann es als ein Anfänger-Protokoll, die funktionelle Relevanz des AMs in Erkrankungen der Atemwege und Lungen Medizin zu zergliedern dienen.

Die Lunge Mikroumgebung ist ein einzigartig Komplexes Ökosystem mit einer aufwendigen Luftleitung und Gefäßsystem. Die eingeatmete Luft geht durch die Luftröhre und durch zahlreiche Zweige der Bronchien und Bronchiolen vor Erreichen der Alveolen, wo die Blut-Luft-Gasaustausch auftritt. Durch direkte Interaktion mit der Atmosphäre erfordert die respiratorische Oberfläche Schutz vor potenziell schädlichen Auswirkungen von luftgetragenen Partikeln und Schadstoffen. Eine Reihe von physikalischen, chemischen und immunologischen Barrieren schützen die Lungen. Bereitstellung von Phagozyten an der respiratorischen Oberfläche dient vor allem eine wichtige Erstlinien Abwehrsystem. Alveoläre Makrophagen (AMs) sind eine Art von Lungenkrebs-Resident Phagozyten, und sie bilden die überwiegende Mehrheit der Lunge Makrophagen Pool. Wie ihr Name schon sagt, AMs sind in erster Linie auf das alveoläre Lumen lokalisiert und treten als festsitzende Zellen, die ständig der Umgebungsatmosphäre zu probieren und die Kommunikation mit der alveoläre Epithel1. Im Steady-State Lunge sind mehr als 95 % der Phagozyten im alveolären Bereich AMs2, deren Zusammensetzung aufgrund von Entzündungen, Infektionen oder chronische Exposition gegenüber Schadstoffen verändern kann.
AMs beteiligen sich eine Vielzahl von Funktionen, die möglicherweise lokal auf die Lunge und/oder systemrelevant. AMs sind beispielsweise wichtig bei der Entwicklung und die optimale Funktion der Lunge; immunüberwachung; und Freigabe der zelltrümmer, eindringende Krankheitserreger und inhalierten Partikel3,4,5,6,7. Gezielte Dezimierung der AMs ist bekannt, Räumung von respiratorischen Viren und Bakterien4,8beeinträchtigen. Neben ihrer Rolle als Phagozyten und eine Erstlinien Verteidiger der pulmonalen Homöostase, AMs sind dafür bekannt, funktionieren wie Antigen-präsentierenden Zellen in entlocken T Zell-Immunität9, die Wirksamkeit der intranasale Impfstoff10 potenzierende und Beeinflussung der Lunge eingeschränkt Autoimmunität nach Lung Transplantation11,12. Mangel AM Funktion ist verbunden worden, um pulmonale alveoläre Proteinosis (PAP), eine Bedingung, die durch eine genetische Mutation, Bösartigkeit oder Infektion, die Clearance von pulmonalen Tenside13,14beeinträchtigt. Transplantation von AMs wird jetzt als einen therapeutischen Ansatz zur Behandlung von PAP- 15,16geprüft.
AMs sind bekannt in der Embryogenese stammen und in den Lungen lebenslang beibehalten, ohne durch zirkulierenden Leukozyten2,17ersetzt. Obwohl AM Umsatz in homöostatische Lunge nicht nachweisbar ist, sind unterschiedlicher AM Umsatz in bestimmten klinischen Bedingungen, einschließlich Infektion berichtet worden, durch das Influenza-Virus4, Bolusinjektion Bestrahlung18, Einwirkung von endotoxin 19und Alter20. AMs werden geglaubt, um über eine minderwertige Verbreitung17,21selbst zu erneuern, aber einige neuen Studien behaupten, dass Monozyten können Anlass zu einer Bevölkerung von intravaskulären Lunge Makrophagen22,23 unter experimentelle Bedingungen, aber Funktionalität diese neu konvertierte pulmonaler Makrophagen haben noch bei Lungenkrankheiten definiert werden. Darüber hinaus ist die verstehen der Schwellenwerts des Reizes im Zusammenhang mit der Aktivierung AM eine potenziell interessante Gegend, wie die Lunge ein Gleichgewicht zwischen den entzündlichen Signalen und immunregulatorische Maschinen zu bewahren versucht.
Die physiologischen oder pathologischen Veränderungen, die zu Verlust der Immunregulation sind wichtig, in verschiedenen klinischen Einstellungen (z. B. Infektionen der Atemwege, entzündliche Lungenerkrankungen und fibrotische Lungenerkrankung) zu bewerten. AMs werden allerdings zunehmend als Indikatoren oder sogar Determinanten der pulmonalen Gesundheit11,24anerkannt. Derzeit gibt es keine einheitliche Protokolle zur Ernte, Charakterisierung und/oder Aufrechterhaltung AMs aus Mensch und präklinischen murinen Modellen. Mangel an Konsens über AM Ausgangsstoffe und Phänotypen und fehlender eine detaillierte Methode das Haupthindernis in Entzifferung Rolle(n) AM pulmonalen Gesundheit und Krankheit gewesen. Das folgende Protokoll bietet ein endgültiges Identifikations-, isoliert und in-vitro- Kultur-Strategie, die stark AM gezielte diagnostische und therapeutische Studien erleichtern und das Verständnis der AM Verhalten wird.

<table><tbody><tr><td>Non-enzymatic cell dissociating solution</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>620300</td><td></td></tr><tr><td>22G Catheter&amp;nbsp;</td><td>Terumo Medical Products</td><td>SR-OX2225CA</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Non-absorbable silk braided suture&amp;nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>SUT-15-2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Lysis buffer (PureLink RNA Kit)</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>M6250&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria II cell sorter&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine&amp;nbsp; (Ketathesia)</td><td>Henry Schein</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine&amp;nbsp; (AnaSed)</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>AMPD1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>100&amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Human Fc block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automated Cell Counter</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>L-929 cell line</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC,&amp;nbsp;CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Corning</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>T25 Tissue culture flask</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>60 mm culture dish&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>CLS3261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conical tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa cell analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>657669</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>v10.4</td><td>Analysis Software</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>147709</td><td>Clone I3/2.3, FITC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td>Clone M1/70, PerCP/Cy5.5 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11c (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>565452</td><td>Clone N418, BV 421 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-I-Ab (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>116420</td><td>Clone AF6-120.1, PE/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-F (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td>Clone E50-2440, PE-CF594 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Siglec-H (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>129605</td><td>Clone 551, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-F4/80 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>123118</td><td>Clone BM8, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6C (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>128035</td><td>Clone HK1.4, BV605 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD64 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>139311</td><td>Clone X54-5/7.1, BV711 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD24 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>563115</td><td>Clone M1/69, BV510 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD103 (Mouse)</td><td>BD Biosciences</td><td>745305</td><td>Clone OX-62, BV650 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD317 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>127015</td><td>Clone 927, APC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CXCR1 (Mouse)</td><td>Biolegend</td><td>149029</td><td>Clone SA011F11, BV785 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD45 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>304017</td><td>Clone HI30, AF488 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD11b (Human)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>Clone M1/70, PE/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-HLA-DR (Human)</td><td>Biolegend</td><td>307618</td><td>Clone L243, APC/Cy7 conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD169 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>346008</td><td>Clone 7-239, APC conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD206 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>321106</td><td>Clone 15-2, PE conjugated</td></tr><tr><td>Anti-CD163 (Human)</td><td>Biolegend</td><td>333612</td><td>Clone GHI/61, BV421 conjugated</td></tr></tbody></table>

isolation and in vitro culture of murine and human alveolar macrophages

Alveoläre Makrophagen sind unheilbar differenzierte, Lunge-Bewohner Makrophagen pränatalen Ursprungs. Alveoläre Makrophagen sind einzigartig in ihrem langen Leben und ihre wichtige Rolle bei der Lungenentwicklung und Funktion sowie ihre Lunge lokalisiert Reaktionen auf Infektionen und Entzündungen. Bisher existiert kein einheitliches Verfahren für die Identifizierung, Isolierung und Handhabung der alveolären Makrophagen von Menschen und Mäusen. Diese Methode ist für Studien über diese wichtigeren angeborenen immunen Zellen in verschiedene experimentelle Einstellungen erforderlich. Die hier beschriebene Methode, die leicht von jedem Labor übernommen werden können, ist ein vereinfachter Ansatz Ernte alveoläre Makrophagen aus alvéolaire Lavage Fluid oder von Lungengewebe und pflegen sie in Vitro. Da alveoläre Makrophagen in erster Linie als adhärente Zellen in den Alveolen auftreten, liegt der Schwerpunkt dieser Methode auf verdrängen sie vor der Ernte und Identifikation. Die Lunge ist ein stark vaskularisierte Organ, und verschiedene Zelltypen myeloischen und lymphatischen Ursprungs bewohnen, interagieren und durch die Lunge Mikroumgebung beeinflusst werden. Mit dem Satz von oberflächenmarker beschrieben hier, können Forscher leicht und eindeutig andere Leukozyten alveoläre Makrophagen unterscheiden und für downstream-Anwendungen reinigen. Die Kultur-Methode entwickelt hierin unterstützt sowohl menschlich als auch Maus alveoläre Makrophagen für in-vitro- Wachstum und ist kompatibel mit zellulären und molekularen Studien.

Der Fluss durchflusszytometrischen Ansatz, Maus AMs zu identifizieren ist in Abbildung 1dargestellt. Dazu gehört die Analyse der einen minimalen Satz von oberflächenmarker notwendig in AMs von anderen Lunge-Resident oder Lunge infiltrieren Fresszellen zu unterscheiden. Differenzialanalyse muss eindeutig identifizieren AMs aus interstitielle Makrophagen, Dendritische Zellen, Neutrophilen, Monozyten und Monocyte abgeleitet pulmonaler Makrophagen, die in der Lunge auftreten. Das folgende Schema der oberflächenmarker kann eingesetzt werden, um leicht unterscheiden diese Zelltypen voneinander wo AMs CD45 sind+, CD11c+, Siglec-F+, CD64+,-Ab + /F4/80-, CD11b- ; Interstitielle Makrophagen sind CD45+, CD11b+,-Ab +, CD64+, CD24-; CD11b + Dendritische Zellen sind CD45+, CD11b+, CD11c+,-Ab +, CD24+, CD64-; CD103 + Dendritische Zellen sind CD45+, CD11c+, CD24+, CD103+,-Ab +, CD11b-; Plasmazytoide Dendritic Zellen sind CD45+, CD317+, Siglec-H+, Ly - 6 C+,-Ab-, neutrophile sind CD45+, Ly - 6 G+, CD11b+, CD11c- ,-Ab -Ly - 6 C–und Monozyten sind CD45+, CD64+ /-, Ly - 6 C+ /-Ab -. Die AM Populationen in rot (CD11cHallo und Siglec-FHallo) und Blaugrün (CD11cHallo, Siglec-FInt) bzw. hervorgehoben darstellen konventionellen AMs (Ballungszentren) und pulmonaler Makrophagen Monocyte abgeleitet ( kleinere Bevölkerung), die in den alveolären Raum auftreten. Sortierung von CD45 fließen+, CD11cHallo, Siglec-FHallo Zellen Erträge gereinigten Maus AMs. Abbildung 2 veranschaulicht Zelle oberflächenmarker notwendig für eine genaue Identifizierung und Isolierung von menschlichen AMs. Die menschliche AMs sind positiv identifiziert als CD45+, CD11b+, HLA-DR+, CD163+, CD169+, und CD206+ BAL Zellen und Informationsfluss für downstream-Anwendungen sortiert werden können.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57287/57287fig1.jpg"> Abbildung 1 : Repräsentative durchflusszytometrischen Analyse der Maus AMs. (A) anatomische Lage des AMs in einem Maus-Lunge-Gewebe-Abschnitt (Hämatoxylin und Eosin). AMs sind mit Pfeilen gekennzeichnet und der Maßstab ist 60 μm. (B) repräsentative Durchflusszytometrie Anspritzung Strategie zur Maus AMs in BAL Zellen zu identifizieren. Proben wurden von einer Zelle Analyzer bewertet und Daten wurden nach unten abgetastet, 500 Veranstaltungen zum Vergleich durch die Analysesoftware. Rot (CD11cHallo und Siglec-FHallo) und Blaugrün (CD11cHallo, Siglec-FInt) sind bzw. konventionelle AMs (Ballungszentren) und Monocyte-abgeleitete pulmonaler Makrophagen (kleinere Bevölkerung). <a href="/files/ftp_upload/57287/57287fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57287/57287fig2.jpg"> Abbildung 2 : Repräsentative durchflusszytometrischen Analyse der menschlichen AMs. (A) Gating Strategie um menschliche AMs von BAL-Flüssigkeit aus einer menschlichen Lunge transplantempfänger zu identifizieren. (B) Hellfeld Schliffbild des menschlichen AMs an sieben Tage der Kultur. Der Maßstab ist 400 μm. <a href="/files/ftp_upload/57287/57287fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Diese Mitteilung beschreibt Methoden zur Isolierung und Kultur der alveolären Makrophagen aus Menschen und murinen Modellen zu Versuchszwecken.

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

isolation-vitro-culture-murine-human-alveolar

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

23.6K Aufrufe.  St. Joseph's Hospital and Medical Center. Diese Mitteilung beschreibt Methoden zur Isolierung und Kultur der alveolären Makrophagen aus Menschen und murinen Modellen zu Versuchszwecken.

Serie: Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Biotechnik

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Isolierung von Murine Peritonealmakrophagen zur Durchführung Genexpressionsanalyse Nach Toll-like Rezeptoren Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing bronchoalveolar lavage (BAL) fluid. The BAL fluid is rich in cells and can thus provide a 'snapshot' of the pulmonary immune milieu. CD4 T cells are the best characterized HIV reservoirs, while there is strong evidence to suggest that tissue macrophages, including alveolar macrophages (AMs), also serve as viral reservoirs. However, much is still unknown about the role of AMs in the context of HIV reservoir establishment and maintenance. Therefore, developing a protocol for processing BAL fluid to obtain cells that may be used in virological and immunological assays to characterize and evaluate the cell populations and subsets within the lung is relevant for understanding the role of the lungs as HIV reservoirs. Herein, we describe such a protocol, employing standard techniques such as simple centrifugation and flow cytometry. The CD4 T cells and AMs may then be used for subsequent applications, including immunophenotyping and HIV DNA and RNA quantification.

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

We describe a method for processing bronchoalveolar lavage fluid and matched peripheral blood from chronically HIV-infected individuals on antiretroviral therapy to assess pulmonary HIV reservoirs. These methods result in the acquisition of highly pure CD4 T cells and alveolar macrophages that may subsequently be used for immunophenotyping and HIV DNA/RNA quantifications by ultrasensitive polymerase chain reaction.

Verarbeitung von Bronchoalveolar Lavage Fluid und Matched Blood für Alveolar Macrophage und CD4+ T-Zell Immunophenotypisierung und HIV Reservoir Assessment

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Isolierung und Kultur residenter kardialer Makrophagen aus dem murinen sinoatrialen und atrioventrikulären Knoten

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...