Die Autoren erkennen die Unterstützung von Forschungsstipendien von National Natural Science Foundation of China (31371390), das Programm des staatlichen Hightech-Development Project (2014AA020702) und das Programm von Guangdong Wissenschaft und Technik (2016B030231001).

Alle tierische Arbeit war gemäss Tierschutzgesetz, institutionellen Richtlinien durchgeführt und durch institutionelle Animal Care and Use Committee, Sun Yat-Sen-Universität genehmigt.
1. Vorbereitung der TEM
<ol><li>Ausführen von Mäusen durch zervikale Dislokation und entfernen Sie die Zungen mit sterile chirurgische Scheren und Pinzetten.</li>
	<li>Tauchen Sie die Zungen in 75 % Ethanol für 3 min, dann setzen jede Zunge in 1,5 mL Eppendorf (EP)-Röhrchen mit 1 mL 10 mM steril Phosphat gepufferte Lösung (PBS). Hinweis: Die Konzentration der PBS in den folgenden Schritten ist identisch mit der Konzentration in diesem Schritt.</li>
	<li>Zell-Lyse durch Frost-Tau-wechseln: Einfrieren der Zungen in EP-Rohre bei-80 ° C für 1 h, und dann auftauen die Zungen bei Raumtemperatur für 45 min 3 Zyklen.</li>
	<li>Laden Sie jede Zunge auf ein Stück der chirurgischen Naht mit einer chirurgischen Nadel und wickeln Sie das Ende der Naht mit einem kleinen Stück sterile Alufolie. Führen Sie den Vorgang in der Kulturschale 3,5 cm oder 6 cm mit 75 % igem Ethanol unter sterilen Bedingungen. Hinweis: Die entsprechende Länge der einzelnen chirurgischen Naht ist ca. 20 cm und die entsprechende Größe der jedes Stück Alufolie ist etwa 0,3 cm2 (1 cm × 0,3 cm). Die Zunge sollte in der Nähe der Alufolie geladen werden.</li>
	<li>Spülen Sie jede Zunge mit 3 mL sterile PBS 30 S. führen diese Operation unter sterilen Bedingungen in der Kulturschale 3,5 cm oder 6 cm.</li>
	<li>Waschen Sie die Zungen mit Reinstwasser: eine Endkonzentration von 90 µg/mL Ampicilin in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL steriles ultrapure Wasser hinzufügen. Legen Sie die Zungen in die Flasche mit einer Stir Bar. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen. Hinweis: Bis zu 5 Sprachen können in der gleichen Flasche unter Berücksichtigung des Nahtmaterials Schlinger genommen werden. Die Alufolie ist am Ende der Naht in der Flasche zu verhindern, dass die Zunge rutscht. Die Zungen sollte 2 cm hoch vom Boden der Flasche durch Einstellen der Länge des Nahtmaterials in der Flasche verbleibende platziert werden. Dieser Hinweis ist auch für Schritte 1,8, 1.10 und 1.12 1.16.</li>
	<li>Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 12 h.</li>
	<li>Waschen Sie die Zungen mit NaCl: Fügen Sie Ampicilin in einer breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 1 M NaCl, eine Endkonzentration von 90 µg/mL. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.</li>
	<li>Zell-Lyse von Triton x-100: Ampicilin hinzufügen, eine Endkonzentration von 90 µg/mL in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 2 % Triton x-100 mit PBS-Puffer. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 48 h.</li>
	<li>Zungen mit CaCl2/MgCl2waschen: eine Endkonzentration von 90 µg/mL Ampicilin in eine breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile 5 mm CaCl2/MgCl2 hinzufügen. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.</li>
	<li>Verdauung durch DNase: Fügen Sie 1 mL Hank es ausgewogen Salzlösung (HBSS) zu jedem EP-Röhrchen. Fügen Sie DNase in HBSS bzw. um eine Endkonzentration von 300 µM. verschieben Sie jede Zunge in jedes EP-Rohr, mit einem Teil des Nahtmaterials außerhalb der Röhre. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass der Teil der Naht, die in die Flaschen in den vorherigen Schritten bleibt auch in der EP-Röhre in diesem Schritt bleibt, und stellen Sie sicher, dass der Teil der Naht, die außerhalb der Flaschen in den vorherigen Schritten bleibt auch außerhalb der EP-Rohr in diesem Schritt bleibt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zungen in EP-Röhrchen bei 37 ° C für 24 h.</li>
	<li>Die Zungen mit PBS waschen: Fügen Sie Ampicilin in einer breit-Mund-Flasche mit 250 mL sterile PBS, eine Endkonzentration von 90 µg/mL. Bewegen Sie die Zungen und Stir Bar in der Flasche. Ziehen Sie die Kronkorken mit Bestandteil der Naht bleibt außerhalb der Flaschenhals. Führen Sie diesen Vorgang unter sterilen Bedingungen.</li>
	<li>Setzen Sie die Flasche auf einen Magnetrührer für 24 h.</li>
	<li>Die vorbereitete TEM in sterilen PBS bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
</ol>(2) dreidimensionale (3D) Rekonstitution von TSCC
<ol><li>
Statische TSCC-Modellbau
	<ol>
<li>1.0 x 106 einzelne TSCC Samenzellen (Cal27) in einer Kulturschale 3,5 cm. Fügen Sie 3 mL Dulbecco des Adlers Medium/F12 (DF12) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 90 µg/mL Ampicilin und 90 µg/mL Kanamycin modifiziert.</li>
		<li>Kultur der Cal27 Zellen bei 37 ° C für 2 bis 3 Tage. Stellen Sie sicher, dass die Zellen von mindestens 60 % decken Bereich der unteren Schale.</li>
		<li>Laden Sie TEM auf der Cal27-Monolayer in der Kulturschale.</li>
		<li>Setzen Sie die Schale in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C für 28 Tage.</li>
		<li>Aktualisieren Sie das Kulturmedium jeden Tag bei der Zelle Kultur. Die CO2 -Konzentration in den Inkubator beträgt 5 %.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gerührten TSCC-Modellbau
	<ol>
<li>
Vorbereitung von einem selbstgebauten gerührten minibioreactor
		<ol>
<li>Nehmen Sie den Kolben aus einer 10 mL Spritze.</li>
			<li>Graben Sie ein Loch (Durchmesser von 1 cm) in der Nähe der Talstation des Stabes und Laden einer Stir Bar in das Loch.</li>
			<li>Graben Sie ein Loch (Durchmesser von 0,5 cm) in der Mitte der Deckel der Flasche eine Plastikflasche breit-Mund und legte die Kolbenstange durch die GAP.</li>
			<li>Schneiden Sie die Hälfte einer 50 mL Zentrifugenröhrchen und auf der äußeren Seite der Deckel der Flasche zu Schweißen.</li>
			<li>Legen Sie Angelhaken auf der Rute durch Umwickeln mit Angelschnüre, die an den Angelhaken gebunden sind. Hinweis: Können bis zu 4 Angelhaken zu einem Stab angebracht werden.</li>
			<li>Autoklaven der selbstgemachten Komplex vor Gebrauch. Hinweis: Führen Sie nicht Autoklaven die Plastikflasche breit-Mund. Verwenden Sie eine neue sterile Plastikflasche breit-Mund während der Kultivierung von Zellen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dynamische Zellkultur
	<ol>
<li>Samen 1.0 x 106 Cal27 Einzelzellen in selbstgebauten Minibioreactor. Hinzugeben Sie 150 mL DF12 Medium enthält 10 % FBS, 90 µg/mL Ampicilin und 90 µg/mL Kanamycin.</li>
		<li>Laden Sie TEM auf der Minibioreactor mit den Angelhaken an der Rute befestigt.</li>
		<li>Ziehen Sie den Deckel und legen Sie die Minibioreactor auf einen Magnetrührer. Aktivieren Sie die Minibioreactor bei 200 u/min in einem CO2 Inkubator bei 37 ° C für 7 bis 14 Tage. Hinweis: Die Konzentration von CO2 in die CO2 Inkubator beträgt 5 %.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Elfring, T., Boliek, C. A., Winget, M., Paulsen, C., Seikaly, H., Rieger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+lingual+and+hypoglossal+nerve+function+and+quality+of+life+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Rehabil%22%5BJournal%5D)">The relationship between lingual and hypoglossal nerve function and quality of life in head and neck cancer.</a> J. Oral Rehabil. 41, 133-140 (2014).</li>
<li>Patel, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+incidence+of+oral+tongue+squamous+cell+carcinoma+in+young+white+women%2C+Age+18+to+44+Years%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increasing incidence of oral tongue squamous cell carcinoma in young white women, Age 18 to 44 Years.</a> J. Clin. Oncol. 29, 1488-1494 (2011).</li>
<li>Zhao, L., Huang, L., Yu, S., Zheng, J., Wang, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tongue+tissue+as+an+in+vitro.+model+for+studying+tongue+cancer+and+tongue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Decellularized tongue tissue as an in vitro. model for studying tongue cancer and tongue regeneration.</a> Acta Biomaterialia. 58, 122-135 (2017).</li>
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<li>Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+decellularization+of+porcine+heart+by+retrograde+coronary+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion.</a> J. Vis. Exp. (6), e50059(2012).</li>
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<li>Ross, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+proliferate+and+differentiate+when+seeded+into+kidney+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).</li>
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<li>Sullivan, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+methods+of+porcine+kidneys+for+whole+organ+engineering+using+a+high-throughput+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system.</a> Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+whole-organ+assembly%3A+moving+toward+transplantation+on+demand%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand.</a> J. Clin. Invest. 122, 3817-3823 (2012).</li>
<li>Song, J. J., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+engineering+based+on+decellularized+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds.</a> Trends Mol. Med. 17, 424-432 (2011).</li>
<li>Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organ+tissue+engineering%3A+decellularization+and+recellularization+of+three-dimensional+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 27-53 (2011).</li>
<li>Shamis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+scaffolds+for+in+vitro+expansion%2C+differentiation%2C+and+organization+of+primary+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C-ME%22%5BJournal%5D)">Organ-specific scaffolds for in vitro expansion, differentiation, and organization of primary lung cells.</a> Tissue Eng. Part C-ME. 17, 861-870 (2011).</li>
<li>Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+rhesus+monkey+kidney+as+a+three-dimensional+scaffold+for+renal+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized rhesus monkey kidney as a three-dimensional scaffold for renal tissue engineering.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2207-2216 (2010).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+acellular+natural+lung+matrix+on+murine+embryonic+stem+cell+differentiation+and+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Pt+A%22%5BJournal%5D)">Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation.</a> Tissue Eng. Pt A. 16, 2565-2580 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Ein gut etabliertes Protokoll für decellularized ECM-Herstellung sollten die native ECM Zusammensetzung beim Entfernen von zellulären Bestandteilen in Geweben behalten fast komplett21. Trotz aktuell gemeldete Decellularization Protokolle erfordern Perfusion durch das Gefäßsystem, zellulare Werkstoffe durch konvektiven Transport entfernen, mechanische Agitation hier, wurde bekannt als eine traditionelle einfache und preiswerte Methode22 , 23 , 24 , 25 , 26. außerdem, da die Zunge reich an Lingualis ist und einige sperrige vaskulären Schiffe hat, dieses Protokoll eignet sich für Zunge Gewebe als andere Protokolle, die oben beschriebenen.
Darüber hinaus führt dieses Protokolls für TEM-Produktion eine entsprechende Moderate Stärke Decellularization, Vermeidung der Zerstörung oder Auflösung der Basis Membran, die durch hochfeste Decellularization verursacht werden kann, wie z. B. Sodium Dodecyl Sulfat ( SDS) Behandlung3. Darüber hinaus das Protokoll auch effektiv gearbeitet in der Muttersprache des Ratte und Schwein (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die Methode häufig auf Zungen von verschiedenen Arten3verwendet werden könnte.
Es ist erwähnenswert, dass es gibt einige wichtige Schritte oder Details in diesem Protokoll, die direkt die Ergebnisse beeinflussen könnten. Ein wichtiger Schritt ist die Verdauung der Zunge Zellen durch DNase. Wenn die Dauer der Verdauung nicht genug ist oder die DNase nicht effizient funktioniert, würde die Decellularization der Zunge kaum erreicht werden. Eine andere Sache, die beachtet werden sollte ist, dass die Drehzahl für den Bioreaktor sollte nicht zu schnell, wenn man bedenkt die Schäden an TEM. Darüber hinaus ist eine sterile Umgebung für diesen Vorgang sehr wichtig im Protokoll.
Trotz der strengen Regeln oben kann das Protokoll für TEM-Vorbereitung zu einem gewissen Grad eingestellt werden. Waschen die Zungen mit Reinstwasser oder PBS für ein paar Stunden mehr als die Zeit die das Protokoll schlägt die Herstellung von TEM offensichtlich nicht beeinträchtigen würde. Aber, da das Protokoll fast eine Woche benötigt um die TEM vorzubereiten, kann nicht es sofort für TEM Anforderungen.
Die TEM zeigt großen Wert in TSCC-Modellbau. Zusammen mit einem selbstgebauten Minibioreactor können hängende Cal27 Zellen in TEM und Form ähnliche infiltrative Struktur ähnelt menschlichen TSCC Histopathologie3anbringen. Dies wäre ein ideales Modell für die Überwachung und Untersuchung der Invasion und Metastasierung von TSCC in Vitro. Das Modell könnte auch die Arbeit an Drogen-Tests auf TSCC profitieren. Unter Berücksichtigung all dieser kann das Protokoll hier großes Potenzial in TSCC Forschung haben.

Die Zunge hat verschiedene wichtige Funktionen wie Schlucken, Artikulation und Verkostung. Die Beeinträchtigung der Funktion der Zunge hat so großen Einfluss auf Patienten Lebensqualität1. Die häufigsten malignen Erkrankungen in der Mundhöhle ist Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür (TSCC), die in der Regel tritt bei Menschen, die Alkohol trinken oder Rauchen Tabak2.
In den letzten Jahren wurden in der Grundlagenforschung auf TSCC wenig Fortschritte erzielt. Der Mangel an effizienter in-vitro- Forschung Modelle bleibt eines der größten Probleme sein. So entpuppt sich die extrazelluläre Matrix (ECM) eine mögliche Lösung sein. Da ECM ein komplexes Netzwerk Frame hochorganisierte Matrix Komponenten zusammengesetzt ist, wäre eine ECM-artige Struktur und Zusammensetzung Gerüstmaterial zuständigen für die Krebsforschung. Decellularized ECM bieten perfekt die Nische für die Zellen aus der gleichen Herkunft in Vitro, die entpuppt sich als der wichtigste Vorteil von ECM.
ECM kann mit zellulären Komponenten aus dem Gewebe durch die Decellularization mit Wasch- und Enzyme entfernt wird einbehalten. Verschiedenen ECM-Komponenten, einschließlich Kollagen, Fibronektin und Laminin in decellularized Matrix bieten eine Native-Gewebe-Like Mikroumgebung für kultivierten Zellen, fördert das Überleben, Proliferation und Differenzierung von Zellen3. Darüber hinaus kann die Immunogenität zur Transplantation auf einem minimalen Niveau mit der Abwesenheit von zellulären Bestandteilen in ECM reduziert werden.
Bisher sind Fertigungsverfahren für decellularized ECM in verschiedenen Geweben und Organen, wie Herz4,5,6,7, Leber8,9,10 versucht worden ,11, Lunge12,13,14,15,16,17und Niere18,19 , 20. keine relevanten Forschung hat jedoch auf ähnliche Arbeiten in der Zunge nach bestem Wissen und gewissen gefunden werden.
In dieser Studie wurde decellularized Zunge extrazelluläre Matrix (TEM) durch eine Reihe von physikalischen, chemischen und enzymatischen Behandlung effizient und kostengünstig hergestellt. Dann wurde die TEM zur TSCC in Vitrorekapitulieren zeigt eine entsprechende Simulation für TSCC Verhalten und Entwicklung. TEM hat gute Biokompatibilität sowie die Fähigkeit, die Zellen der Gewebe-spezifische Nische zu führen gibt an, dass TEM ein großes Potenzial in TSCC Forschung3haben kann. Die hier gezeigte Protokoll bietet eine Auswahl für Forscher auf Pathogenese oder Therapien von TSCC.

<table><tbody><tr><td>C57-BL/6J mice</td><td>Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td><td>HB15-GR-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100395</td><td></td></tr><tr><td>Dibasic Sodium Phosphate</td><td>Guangzhou Chemical Reagent Factory</td><td>BE14-GR-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501211</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL EP tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-A</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-low temperature freezer&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm cell culture dish</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>6 cm cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900502</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449164</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulphate</td><td>Sangon Biotech</td><td>A601988</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158968</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1487</td><td></td></tr><tr><td>Surgical suture</td><td>Shanghai Jinhuan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL wide-mouth bottle</td><td>SHUNIU</td><td>1407</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>AS ONE</td><td>1-4602-32</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>SHEL LAB</td><td>SCO5A</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>Hunan Pingan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL centrifuge tube</td><td>Greiner</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>Cal27 cell</td><td>Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank</td><td></td><td>Tongue squamous cell carcinoma cell line</td></tr><tr><td>U2OS cell</td><td>Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank</td><td></td><td>Human osteosarcoma cell line</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0547</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Hepes free acid</td><td>BBI</td><td>A600264</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C fridge</td><td>Haier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water purifier</td><td>ELGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>BLAU</td><td>717805</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of tongue extracellular matrix and reconstitution of tongue squamous cell carcinoma in vitro

Um eine effektive und realistische Modell für Zunge Plattenepithelkarzinom Karzinom (TSCC) in Vitrozu konstruieren, die Methoden zu produzieren decellularized Zunge extrazelluläre Matrix (TEM) entstanden funktionelle Gerüste für TSCC Bau bietet. TEM bietet eine in-vitro- Nische für Zellwachstum und Differenzierung Zellmigration. Die Mikrostrukturen der native extrazelluläre Matrix (ECM) und biochemische Kompositionen aufbewahrt in der decellularized Matrix bieten gewebespezifischen Nischen für die Verankerung von Zellen. Die Herstellung von TEM kann durch Deoxyribonuclease (DNase) Verdauung begleitet mit einer schweren organischen oder anorganischen Vorbehandlung realisiert werden. Dieses Protokoll ist einfach zu bedienen und sorgt für hohe Effizienz für die Decellularization. Die TEM zeigte günstige Cytocompatibility für TSCC Zellen unter statischen oder gerührt Kulturbedingungen, ermöglicht den Bau des Modells TSCC. Ein self-made-Bioreaktor wurde auch für die anhaltende gerührt Bedingung für die Zellkultur verwendet. Rekonstruierte TSCC mit TEM zeigte die Merkmale und Eigenschaften ähnlich klinische TSCC Histopathologie, was darauf hindeutet das Potenzial in der TSCC Forschung.

Dieses Protokoll für die Vorbereitung der TEM entpuppt sich als effizient und angemessen. Die TEM zeigte perfekte Decellularization im Vergleich mit Muttersprache Gewebe. Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung (Abbildung 1A-B) bestätigte die Wirksamkeit von Decellularization. Die HE-Färbung Ergebnisse ergab völlige Verschwinden der nuklearen Färbung in TEM (Abbildung 1B). Darüber hinaus zeigten DNA Inhalt Quantifizierung von früheren Arbeiten, dass DNA von TEM3fast vollständig entfernt wurde. Dieses Protokoll zeigte auch seltene Schäden an Gewebe Integrität beim Entfernen von Zellkomponenten (Abbildung 1B).
3D Rekonstruktion des TSCC TEM mit einer selbstgemachten Minibioreactor (Abbildung 2A-B) erzielt zufriedenstellende Ergebnisse. ER Färbung zeigte, dass Cal27 Zellen in der TEM typische TSCC pathologischen Merkmale (Abbildung 2C-D) vorgestellt. Die Zellen in gerührten Kulturbedingungen dargestellt einzellige Migration (Abbildung 2C) oder kollektiven Migration (Abbildung 2D) in verschiedenen Läsion Bereichen. In statischen Kulturbedingungen Cal27 Zellen auch invasive Strukturen in der TEM gebildet, aber es hat länger gedauert (Abb. 2E). Darüber hinaus wurde eine menschlichen Osteosarkom-Zelllinie U2OS auch mit dem gleichen gerührt Kultursystem eingeführt. Obwohl U2OS Zellen in das Kulturmedium Leben konnte, waren sie nicht in der TEM (Abbildung 2F) gefunden. Die TEM zeigte verschiedene Biokompatibilität für verschiedene Arten von Krebszellen, was darauf hindeutet, dass verschiedene Tumorzellen möglicherweise unterschiedliche Mikroumgebungen zu florieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57235/57235fig1.jpg"> Abbildung 1 : Vorbereitung der TEM. (A) HE Färbung der Muttersprachen von Mäusen. Maßstabsleiste = 100 µm. (B) HE Färbung des decellularized TEM von Mäusen. Maßstabsleiste = 100 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57235/57235fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57235/57235fig2.jpg"> Abbildung 2 : Wiederherstellung der TSCC durch TEM. (A) den Überblick über ein self-made Minibioreactor. (B) die Ansicht der TEM Ladeposition ein self-made Minibioreactor. (C) er Färbung des 14-tägigen gerührt kultivierten TSCC mit TEM. Einzelne Zelle Invasion Phänomene sind durch Schwarze Pfeile angedeutet. Maßstabsleiste = 50 µm. (D) er Färbung des 14-tägigen gerührt kultivierten TSCC mit TEM. Kollektive Invasion Phänomene sind durch Schwarze Pfeile angedeutet. Maßstabsleiste = 50 µm. (E) er Färbung der 28-Tage-statische TSCC mit TEM kultiviert. Einzelne Zelle Invasion Phänomene sind durch Schwarze Pfeile angedeutet. Maßstabsleiste = 100 µm. (F) HE Färbung des 14-tägigen gerührt kultivierten U2OS Zellen mit TEM. Maßstabsleiste = 50 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57235/57235fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Herstellung von Zunge extrazellulären Matrix und Rekonstitution der Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür In-vitro-

Hier wird eine Methode für die Vorbereitung der Zunge extrazellulären Matrix (TEM) mit effizienten Decellularization angezeigt. Die TEM kann als funktionelle Gerüste für den Wiederaufbau eines Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür (TSCC) Modells unter statischen oder gerührt Kulturbedingungen verwendet werden.

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

fabrication-tongue-extracellular-matrix-reconstitution-tongue

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

6.2K Aufrufe.  Sun Yat-sen University. Hier wird eine Methode für die Vorbereitung der Zunge extrazellulären Matrix (TEM) mit effizienten Decellularization angezeigt. Die TEM kann als funktionelle Gerüste für den Wiederaufbau eines Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür (TSCC) Modells unter statischen oder gerührt Kulturbedingungen verwendet werden.

Serie: Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Forschung

Medizin

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

Voll menschliche Tumor-basierte Matrix im dreidimensionalen Spheroid-Invasions-Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Krebsforschung

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by introducing specific mutations in oncogenes and tumor suppressor genes, using clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-based genome editing technology in mice. This technology allows us to accurately mimic the genetic changes that occur in human cancers using mice. By genetically transforming murine primary cells, we can better study cancer development, progression, treatment, and diagnosis. In this study, we used Cre-inducible Cas9 mouse tongue epithelial cells to enable genome editing using adeno-associated virus (AAV) in vitro. Specifically, by altering KRAS, p53, and APC in normal tongue epithelial cells, we generated a murine head and neck cancer (HNC) cell line in vitro,which is tumorigenic in syngeneic mice. The method presented here describes in detail how to generate HNC cell lines with specific genomic alterations and explains their suitability for predicting tumor progression in syngeneic mice. We envision that this promising method will be informative and useful to study tumor biology and therapy of HNC.

Development of murine models with specific genes mutated in head and neck cancer patients is required for understanding of neoplasia. Here, we present a protocol for in vitro transformation of primary murine tongue cells using an adeno-associated virus-Cas9 system to generate murine HNC cell lines with specific genomic alterations.

In Vitro Einrichtung einer gentechnisch veränderten Murine Kopf- und Halskrebszelllinie mit einem Adeno-assoziierten Virus-Cas9-System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Multidimensional Coculture System to Model Lung Squamous Carcinoma Progression

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions contribute to tissue architectural changes observed during tumorigenesis remains challenging due to the lack of appropriate models. In this protocol, we describe the generation of a 3D coculture model using a LUSC primary cell culture known as TUM622. TUM622 cells were established from a LUSC patient-derived xenograft (PDX) and have the unique property to form acinar-like structures when seeded in a basement membrane matrix. We demonstrate that TUM622 acini in 3D coculture recapitulate key features of tissue architecture during LUSC progression as well as the dynamic interactions between LUSC cells and components of the tumor microenvironment (TME), including the extracellular matrix (ECM) and cancer-associated fibroblasts (CAFs). We further adapt our principal 3D culturing protocol to demonstrate how this system could be utilized for various downstream analyses. Overall, this organoid model creates a biologically rich and adaptable platform that enables one to gain insight into the cell-intrinsic and extrinsic mechanisms that promote the disruption of epithelial architectures during carcinoma progression and will aid the search for new therapeutic targets and diagnostic markers.

An in vitro model system was developed to capture tissue architectural changes during lung squamous carcinoma (LUSC) progression in a 3-dimensional (3D) co-culture with cancer-associated fibroblasts (CAFs). This organoid system provides a unique platform to investigate the roles of diverse tumor cell-intrinsic and extrinsic changes that modulate the tumor phenotype.

Multidimensionales Cokultursystem zur Modellierung der Fortschreitender Karzinomprogression der Lunge

Tumor-stroma interactions play a critical role in the development of lung squamous carcinoma (LUSC). However, understanding how these dynamic interactions ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Tissue Engineering von Tumor-Stroma-Mikromilieu mit Anwendung auf die Invasion von Krebszellen

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Biotechnik

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all human squamous cell carcinomas. Despite recent progress in defining the molecular changes accompanying ESCC initiation and development, patient prognosis remains poor. The functional annotation of these molecular changes is the necessary next step and requires models that both capture the molecular features of ESCC and can be readily and inexpensively manipulated for functional annotation. Mice treated with the tobacco smoke mimetic 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) predictably form ESCC and esophageal preneoplasia. Of note, 4NQO lesions also arise in the oral cavity, most commonly in the tongue, as well as the forestomach, which all share the stratified squamous epithelium. However, these mice cannot be simply manipulated for functional hypothesis testing, as generating isogenic mouse models is time- and resource-intensive. Herein, we overcome this limitation by generating single cell-derived three-dimensional (3D) organoids from mice treated with 4NQO to characterize murine ESCC or preneoplastic cells ex vivo. These organoids capture the salient features of ESCC and esophageal preneoplasia, can be cheaply and quickly leveraged to form isogenic models, and can be utilized for syngeneic transplantation experiments. We demonstrate how to generate 3D organoids from normal, preneoplastic, and SCC murine esophageal tissue and maintain and cryopreserve these organoids. The applications of these versatile organoids are broad and include the utilization of genetically engineered mice and further characterization by flow cytometry or immunohistochemistry, the generation of isogeneic organoid lines using CRISPR technologies, and drug screening or syngeneic transplantation. We believe that the widespread adoption of the techniques demonstrated in this protocol will accelerate progress in this field to combat the severe burden of ESCC.

This protocol describes the key steps to generate and characterize murine oral-esophageal 3D organoids that represent normal, preneoplastic, and squamous cell carcinoma lesions induced via chemical carcinogenesis.

Modellierung des oral-ösophagealen Plattenepithelkarzinoms in 3D-Organoiden

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA sequencing and primary cell culture). Yielding viable, healthy cells in large quantities is critical, and the optimal conditions to do so are tissue dependent. Cell populations in the tongue epithelium and underlying mesenchyme/connective tissue are heterogeneous and tissue structures vary in different regions and at different developmental stages. We have tested protocols for isolating cells from the mouse tongue epithelium and mesenchyme/connective tissue in the early developmental [embryonic day 12.5 (E12.5)] and young adult (8-week) stages. A clean separation between the epithelium and underlying mesenchyme/connective tissue was easy to accomplish. However, to further process and isolate cells, yielding viable healthy cells in large quantities, and careful selection of enzymatic digestion buffer, incubation time, and centrifugation speed and time are critical. Incubation of separated epithelium or underlying mesenchyme/connective tissue in 0.25% Trypsin-EDTA for 30 min at 37 &#176;C, followed by centrifugation at 200 x g for 8 min resulted in a high yield of cells at a high viability rate (&#62;90%) regardless of the mouse stages and tongue regions. Moreover, we found that both dissociated epithelial and mesenchymal/connective tissue cells from embryonic and adult tongues could survive in the cell culture-based medium for at least 3 h without a significant decrease of cell viability. The protocols will be useful for studies that require the preparation of isolated cells from mouse tongues at early developmental (E12.5) and young adult (8-week) stages requiring cell dissociation from different tissue compartments.

We have developed a generalized protocol to dissociate a large quantity of high-quality single cells from the epithelium and mesenchyme/connective tissue of embryonic and adult mouse tongues.

Zelldissoziation aus dem Zungenepithel und Mesenchym/Bindegewebe von embryonalen 12,5 und 8 Wochen alten Mäusen

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Entwicklungsbiologie

Generation and Characterization of Murine Oral Mucosal Organoid Cultures

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, gingiva, lips, palate, and tongue. Its uppermost layer, the oral epithelium, is maintained by adult stem cells throughout life. Proliferation and differentiation of adult epithelial stem cells have been intensively studied using in vivo mouse models as well as two-dimensional (2D) feeder-cell based in vitro models. Complementary to these methods is organoid technology, where adult stem cells are embedded into an extracellular matrix (ECM)-rich hydrogel and provided with a culture medium containing a defined cocktail of growth factors. Under these conditions, adult stem cells proliferate and spontaneously form three-dimensional (3D) cell clusters, the so-called organoids. Organoid cultures were initially established from murine small intestinal epithelial stem cells. However, the method has since been adapted for other epithelial stem cell types. Here, we describe a protocol for the generation and characterization of murine oral mucosal organoid cultures. Primary epithelial cells are isolated from murine tongue tissue, embedded into an ECM hydrogel, and cultured in a medium containing: epidermal growth factor (EGF), R-spondin, and fibroblast growth factor (FGF) 10. Within 7 to 14 days of initial seeding, the resulting organoids can be passaged for further expansion and cryopreservation. We additionally present strategies for the characterization of established organoid cultures via 3D whole-mount imaging and gene-expression analysis. This protocol may serve as a tool to investigate oral epithelial stem cell behavior ex vivo in a reductionist manner.

<meta charset="utf8"></head><body>Generierung und Charakterisierung von organoiden Kulturen der murinen Mundschleimhaut

We present a method for the generation and characterization of oral mucosal organoid cultures derived from the tongue epithelium of adult mice.

Generierung und Charakterisierung von organoiden Kulturen der murinen Mundschleimhaut

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, ...

Biologie

Isolation of Circumvallate Papillae (CVP) Epithelium from Mouse Model: An Enzymatic Procedure to Separate CVP Epithelium from Mouse Tongue

Source: Shechtman, L. A. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/62300" target="_blank">Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells</a>. J. Vis. Exp. (2021)
In this video, we describe the isolation of circumvallate papillae (CVP) epithelium from a murine tongue.

Isolation of Circumvallate Papillae CVP Epithelium from Mouse Model: An Enzymatic Procedure to Separate CVP Epithelium from Mouse Tongue

Isolierung von zirkumvallaten Papillen (CVP) Epithel aus Mausmodell: Ein enzymatisches Verfahren zur Trennung von CVP-Epithel aus der Mauszunge

Source: Shechtman, L. A. et al. Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells. J. Vis. Exp. (2021)
In this video, ...

Herstellung von Zunge extrazellulären Matrix und Rekonstitution der Zunge Squamous Zelle Krebsgeschwür In-vitro-

Zusammenfassung

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Zelldissoziation aus dem Zungenepithel und Mesenchym/Bindegewebe von embryonalen 12,5 und 8 Wochen alten Mäusen

Generierung und Charakterisierung von organoiden Kulturen der murinen Mundschleimhaut

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Isolierung von zirkumvallaten Papillen (CVP) Epithel aus Mausmodell: Ein enzymatisches Verfahren zur Trennung von CVP-Epithel aus der Mauszunge