Diese Arbeit wurde von Diabetes Kanada unterstützt.

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Fettleibige Mäusen ergab folgenden HF-Diät ernähren, Körper und weißen Fettgewebe Gewichte im Vergleich zu Mäusen eine N-Diät gefüttert zugenommen haben. RNA mit Phenol Lösung ergab Proben mit guter Reinheit extrahiert. Leptin ist ein Adipokine produziert in erster Linie von Fettgewebe und positiv korrelieren mit fat mass16bekannt. Wie erwartet erhöht Leptin mRNA Ausdruck bei fettleibigen Mäusen in Tateinheit mit ihrer Fettmasse.
Diese Methode hat mehrere wichtige Schritte. Die große ist Verunreinigung von einem weißen Fettgewebe Depot mit einem anderen es ist bekannt, dass verschiedene Fettgewebe-Depots unterschiedliche Funktionen2,5 haben. Verunreinigungen kann irreführende Ergebnisse in downstream-Anwendungen bringen. Darüber hinaus als Fett neigt dazu, einmal in Kontakt mit Luft, weißen Fettgewebe eine regelmäßige und konsequente Tempo zwischen Mäuse sammeln trocknen ist empfehlenswert, wenn das Gewicht muss genommen werden. Andernfalls könnte das Gesamtgewicht von einem Fettpolster falsch sein. Um RNA von guter Qualität und Ertrag, nach der vor kurzem veröffentlichten MIQE Leitlinien ist eine Gewinn-17. Insbesondere kann sehr feine Probe Pulver beim Schleifen machen helfen Ertrag zu maximieren. Dies maximiert den Kontakt zwischen der Gewebe Pulver und Phenol-Lösung während RNA isoliert. Nicht zuletzt ist die Isolation der RNA-haltigen Schicht während die RNA-Isolierung (Schritt 3.12). Da Fett weniger dicht als Wasser ist, ist es am Anfang der Phase des Interesses positioniert. Minimierung der Verschleppung von Fett ist notwendig um Störungen mit downstream-Anwendungen zu verringern.
Eine Einschränkung dieser Methode ist die Fähigkeit erforderlich, um mehrere Schritte des Verfahrens sowie die Notwendigkeit, mit schädlichen Reagenzien während RNA Isolierung arbeiten durchführen. Darüber hinaus ist der gesamte Prozess arbeitsintensiv.
Es gibt nicht viele Alternativen, um die Methode der Fettgewebe Sammlung und Verarbeitung vor der RNA Isolierung abgesehen von Kleinigkeiten, die in der Regel vom jeweiligen Benutzer angepasst werden. Im Fall von RNA Isolierung gibt es viele Möglichkeiten wie das Phenol/Chloroform Extraktion oder RNA Isolierung Kits. Es gibt vor- und Nachteile für jede Option und es obliegt dem Benutzer, die beste Methode, basierend auf nachgelagerte Anwendungen auszuwählen. Phenol/Chloroform Extraktion ist weniger teuer, aber erfordert den Einsatz von schädlichen Reagenzien und ist mühsam. RNA-Isolierung-Kits sind in der Regel teurer, aber das Verfahren ist schneller und liefert in der Regel Proben mit guter Qualität und Reinheit. Es ist wichtig, den Ertrag und die Reinheit der RNA zu betrachten, da das Material im weißen Fettgewebe besteht, vor allem Fett begrenzt ist. Der große Vorteil bei der Verwendung von Phenol-Lösung für die Isolierung (Phenol/Chloroform Extraktion) besteht die Möglichkeit der Isolierung der RNA, DNA und Proteine aus einer einzigen Probe18. Dies ist kosteneffektiv und Zeit, da es die Anzahl der Mäuse erforderlich reduziert, um ausreichend Material zu erhalten. Wie bereits erwähnt, ist die Fettmasse in einige Mausmodelle begrenzt. Für diese Mäuse ist Spaltung Fettgewebe Boden in drei Teile getrennt RNA, DNA und Proteine zu erhalten nicht empfohlen, da dies zu nicht genügend Material für downstream-Anwendungen führen könnte. Um dieses Problem zu umgehen, ist es auch möglich zu bündeln ähnlich Fettgewebe Depot von mehreren Mäusen basierend auf benutzerdefinierten Kriterien führt zu einer erhöhten Anzahl von Tieren erforderlich.

Adipositas ist eine weltweite Epidemie Komplikationen wie Typ 2 Diabetes1führen kann. Diät-induzierten fettleibig und gentechnisch veränderten Tiermodelle sind häufig in Übergewicht und die damit verbundenen Komplikationen für die Forschung verwendet. Traditionell weißen Fettgewebe ist bekannt als ein Ablagefach für überschüssige Energie und besteht hauptsächlich aus Lipiden während braunes Fettgewebe Energie in Wärme2,3 wandelt. Fettgewebe ist dynamisch erweitern und verkleinern abhängig von vielen Faktoren wie Ernährung und körperliche Aktivität. Um Faktoren auf diese Veränderungen zu bestimmen, sind daher ausreichend Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung erforderlich4.
Unter weißen Fettgewebe ist es allgemein anerkannt, dass viszeralen und subkutanen Fettdepots unterschiedliche Eigenschaften wie die anatomische Lokalisierung haben und Funktion2,5. Folglich muss zur Vermeidung von widersprüchlichen Ergebnissen oder große Variabilität Aufmerksamkeit getroffen werden, um Kreuzkontaminationen zwischen diesen verschiedenen Fettdepots beim Fettpolster zu sammeln.
Darüber hinaus gibt es drei große Herausforderungen, wenn Sie RNS oder Protein aus Mäusen weißen Fettgewebe zu isolieren. Erstens ist die Fettpolster bei fettleibigen Mäusen sammeln nicht leichte Aufgabe wie die Grenze trennt verschiedene weiße Fettdepots nicht immer klar, im Gegensatz zu anderen Organen wie Niere und Herz6. Zweitens wegen der hohen Fettgehalt des Fettgewebes, während RNS oder Protein isoliert, eine Schicht von Lipiden obenauf schwimmt und verhindert den direkten Zugriff auf die Probe. Drittens: im Gegensatz zu braunen Fettgewebe oder anderen Geweben, weißen Fettgewebe hat erheblich niedrigeren Gehalt an RNA und Protein und dies ist von großer Bedeutung bei der Verwendung von junger Mäusen, Mäuse eine normale (N) Diät gefüttert und Mäuse, die voraussichtlich haben geringe Dicke Massen (d.h. KO Modelle, Behandlung mit Medikamenten, Übung, Training, etc..) 7 , 8.
Daher ist es wichtig, auswählen der geeigneten Methode, die RNA aus Fettgewebe zu isolieren. Alternative Methoden zur Phenol/Chloroform Extraktion sind kommerzielle Kits. Sie basieren in der Regel auf eine anfängliche Phenol Extraktionsschritt, gefolgt von RNA-Reinigung auf eine Spalte9. Diese Kits sind in der Regel teurer und Proben von geringeren Ertrag zu geben, während die RNA-Qualität Variable möglicherweise jedoch sind weniger zeitaufwändig. Einer der größten Vorteile der Phenol-Lösung/Chloroform Extraktion hier beschriebene ist jedoch die Möglichkeit der Isolierung von RNA, DNA und Proteine aus einer einzigen Probe10. Da Mäuse Fettpolster meist klein sind und kleine Menge von RNA und Proteinen (insbesondere schlanke Maus-Modellen geben), maximieren Sie diese Protokolle die Daten, die man aus einer kleinen Probe abbekommt.
Das Ziel dieses Papiers ist es, im Detail beschreiben eine Methode, um adäquate Probenentnahme aus drei Mäuse weißen Fettgewebe Depots sowie Menge und Qualität der RNA Isolierung zu gewährleisten. RNA durch Anschluss an dieses Protokoll erhalten kann verwendet werden, um Echtzeit-PCR-Tests durchzuführen. Dieses Protokoll dient nicht zur RNA-Isolierung aus kultivierten primäre Adipozyten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1003px;" width="1002">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">1 mL seringes</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA&#8226;Na2. pH 8.0)</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">22 G needles</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">26 G needles</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">75% Ethanol</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Block heater (dry bath)</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2432-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">dATP&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:189px;">R0141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">dCTP&#160;&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:189px;">R0151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">dGTP&#160;&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:189px;">R0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">DNase I (1 U/&#181;l)&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:189px;">EN0521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">dTTP&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:189px;">R0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Faststart Universal SYBR green Master (Rox)</td>
			<td style="width:189px;">Roche</td>
			<td style="width:189px;">4913922001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Roche</td>
			<td style="width:189px;">4913914001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Filtered tips</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Instrumentarium</td>
			<td>HB275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Gauze</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Hammer</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">High fat rodent diet</td>
			<td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td>
			<td style="width:189px;">F3282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Isopropanol&#160;</td>
			<td>Laboratoire MAT</td>
			<td>IH-0101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:457px;">Leptin forward PCR primer (5&#8217;-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3&#8217;) 10 uM</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:457px;">Leptin reverse PCR primer (5&#8217;-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3&#8217;) 10 uM</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer)</td>
			<td style="width:189px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:189px;">EP0742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Nanopure water (referred as ultrapure water)</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Nitrile examination gloves</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Nitrile gloves</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:457px;">Normal rodent diet</td>
			<td style="width:189px;">Harlan Laboratories, Madison, WI</td>
			<td style="width:189px;">Harlan 2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">P1000 pipetman</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">P2 pipetman</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">P20 pipetman</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">P200 pipetman</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Phenol solution (TRIzol)&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Ambion Life Technologies</td>
			<td style="width:189px;">15598018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Pre-identified aluminium foil</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Quartz spectrophotometer cuvette</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rack for PCR tube strips</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Racks for RT-PCR tube strips</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Random hexamers&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:189px;">58875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:457px;">Real-time PCR Rotor Gene system&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Corbett research</td>
			<td style="width:189px;">RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Refrigerated bench-top centrifuge</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">RiboLock RNase Inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:189px;">EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">RNase-free 1.5 mL screw cap tubes</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">RNase-free water&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Hyclone</td>
			<td style="width:189px;">SH30538.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">RT-PCR machine</td>
			<td style="width:189px;">Qiagen</td>
			<td style="width:189px;">Rotor-Gene Corbett 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:457px;">S16 forward PCR primer (5&#8217;-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3&#8217;) 10 uM</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:457px;">S16 reverse PCR primer (5&#8217; ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3&#8217;) 10 uM</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:189px;">Biochrom</td>
			<td style="width:189px;">Ultrospec 3100 pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Stainless steel mortar and pestle</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="height:77px;width:457px;">Surgical pads</td>
			<td style="width:189px;">Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Surgical scissors&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Intrumentarium</td>
			<td style="width:189px;">130.450.11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Thermal cycler</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Thermal cycler&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Biometra</td>
			<td style="width:189px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:457px;">Weighing spatula</td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse adipose tissue collection and processing for rna analysis

Im Vergleich zu anderen Geweben, hat weißen Fettgewebe einen deutlich weniger RNA und Protein Inhalt für downstream-Anwendungen wie Real-Time PCR und Western-Blot, da es meist Lipide enthält. RNA Isolation aus Fettgewebe Proben ist auch herausfordernd, da zusätzliche Schritte erforderlich sind, um diese Lipide zu vermeiden. Hier präsentieren wir Ihnen ein Verfahren um drei anatomisch unterschiedlichen weißen Fettgewebe von Mäusen, verarbeiten diese Proben und durchführen von RNA Isolierung zu sammeln. Wir beschreiben weiter die Synthese der cDNA und gen-Ausdruck-Experimente mittels Real-Time PCR. Das hiermit beschriebene Protokoll ermöglicht die Reduzierung der Kontamination von Haar und Blut auf Fettpolster sowie Cross-Kontamination zwischen verschiedenen Fettpolster bei der Entnahme von Gewebe des Tieres. Es wurde auch optimiert, um angemessene Quantität und Qualität der extrahierten RNA zu gewährleisten. Dieses Protokoll kann weit angewendet werden, um jede Maus-Modell wo Fettgewebe Proben für routinemäßige Experimente wie Real-Time PCR erforderlich sind, aber ist nicht zur Isolation von primären Adipozyten Zellkultur.

Nach der Autopsie Prozedur wurden drei weißen Fettgewebe gesammelt und aus den zwei Gruppen von Mäusen (N und HF Diät gefüttert Mäuse) gewichtet. Wie erwartet, stieg Mäuse auf der HF-Diät endgültige Körpergewicht und Gewichtszunahme im Vergleich zu Wurfgeschwistern N Diät (Tabelle 1). Diese Beobachtungen wurden begleitet von mehr als eine 2-fache Erhöhung des Gewichts der SCF, PGF und PRF bei fettleibigen Mäusen im Vergleich zu den N-Diät.
Vor der Durchführung keine Experimente mit der isolierten RNA, wurde seine Reinheit bewertet, wie unter Punkt 4.9 beschrieben. Für jeden weißen Fettgewebe produziert RNA Isolierung von Phenol-Lösung Proben mit ausreichender Qualität als das Verhältnis war OD260/OD280 etwa 2,0 als reine RNA (Tabelle 2) gilt. Echtzeit-PCR-Daten zeigten, dass Leptin mRNA Expression in PGF, PRF und SCF von fettleibigen Mäusen im Vergleich zu den N-Diät (Abb. 4A) deutlich erhöht wurde. In der Tat waren die Unterschiede im Leptin mRNA Ausdruck nicht durch eine Variation der s16, das Referenz-gen verwendet, um die Ergebnisse zwischen den beiden Gruppen von Mäusen zu normalisieren, wie Ct-Werte nicht verändert wurden (Abbildung 4B). So können s16 zuverlässig einsetzbar als Referenz-gen für die mRNA Expression in PGF, PRF und SCF bei HF-Diät ein Parameter in einem Studienprotokoll ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57026/57026fig1.jpg"> Abbildung 1 . Anatomische Lokalisation des weißen Fettgewebes an Mäusen. Eine männliche Maus N Diät hat seziert, um die Lokalisierung der einzelnen Fettgewebe Depot und Nebennieren zu zeigen. SCF (A), PGF (B), PRF (C) und Nebenniere (D). PGF, Peri-Gonaden Fett; PRF, Peri-renal Fett; SCF, subkutane Bauchfett. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57026/57026fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57026/57026fig2.jpg"> Abbildung 2 . RNA Isolation Protokoll Flussdiagramm mit Phenol Lösung. Schematische Darstellung der erforderlichen Schritte, um RNA von geerdeten weißen Fettgewebe zu isolieren. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57026/57026fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57026/57026fig3.jpg"> Abbildung 3 . RNA-Qualitätsbewertung auf Bleichmittel-Gel. 1 Ug RNA isoliert von subkutanen Fettgewebes (SCF) und Peri-Gonaden Fett (PGF) ist auf einer 1 % Agarosegel Bleichmittel durch Elektrophorese getrennt. 28 s und 18 s rRNA werden durch UV-Durchleuchtung visualisiert. Gel sind RNA isoliert vom SCF und PGF einer Maus eine normale Diät ernährt. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57026/57026fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57026/57026fig4.jpg"> Abbildung 4 . Wirkung von HF-Diät auf Leptin und s16 mRNA Expression im weißen Fettgewebe. Leptin (A) und s16 (B) mRNA Ausdruck. Daten für Leptin sind normiert auf s16 mRNA-Niveaus, während Daten für s16 als Ct Wert dargestellt werden und sowohl als Mittelwert ± SE mit n = 12-13 pro Gruppe. * p < 0,05 im Vergleich zu N-Diät. N, normal; HF, fettreiche; PGF, Peri-Gonaden Fett; PRF, Peri-renal Fett; SCF, subkutane Bauchfett. Diese Zahl verändert wurde, von Tan, p. Et Al, Adipositas (2014) 22, 2201-2209. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57026/57026fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>N-Diät</td>
			<td>HF-Diät</td>
		</tr>
<tr>
<td>Endgültigen Körpergewicht (g)</td>
			<td>37,5 ± 1,3</td>
			<td>46.7 ± 1.7*</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gewichtszunahme (g)</td>
			<td>6,6 ± 0,7</td>
			<td>16,7 ± 1.0*</td>
		</tr>
<tr>
<td>PGF (g)</td>
			<td>1,08 ± 0,17</td>
			<td>2.19 ± 0.15*</td>
		</tr>
<tr>
<td>PRF (g)</td>
			<td>0,79 ± 0.15</td>
			<td>1.71 ± 0.06</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCF (g)</td>
			<td>1,62 ± 0,35</td>
			<td>3,55 ± 0.20*</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Wirkung von HF-Diät auf Körper und weißen Fettgewebe Gewichte. Werte werden ausgedrückt als Mittel ± SE mit n = 14-15 pro Gruppe. * p < 0,05 im Vergleich zu N-Diät. N, normal; HF, fettreiche; PGF, Peri-Gonaden Fett; PRF, Peri-renal Fett; SCF, subkutane Bauchfett. Diese Zahl verändert wurde, von Tan, p. Et Al, Adipositas (2014) 22, 2201-2209.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Proben</td>
			<td>Verhältnis OD260/OD280</td>
		</tr>
<tr>
<td>PGF 1</td>
			<td>2.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>PGF 2</td>
			<td>2.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>PGF 3</td>
			<td>2.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>PRF 1</td>
			<td>1.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>PRF 2</td>
			<td>2.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>PRF 3</td>
			<td>2.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCF 1</td>
			<td>2.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCF 2</td>
			<td>2.02</td>
		</tr>
<tr>
<td>SCF 3</td>
			<td>2.06</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: RNA-Reinheit nach Isolation von weißen Fettgewebe. n = 3 pro Fettgewebe. PGF, Peri-Gonaden Fett; PRF, Peri-renal Fett; SCF, subkutane Bauchfett.

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Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse

Dieses Papier soll eine schrittweise Anleitung zu sammeln verschiedene weißen Fettgewebe von Mäusen, die Fett Proben zu verarbeiten und RNA extrahieren zu präsentieren.

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

mouse-adipose-tissue-collection-and-processing-for-rna-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

48.1K Aufrufe.  Université de Montréal. Dieses Papier soll eine schrittweise Anleitung zu sammeln verschiedene weißen Fettgewebe von Mäusen, die Fett Proben zu verarbeiten und RNA extrahieren zu präsentieren.

Serie: Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not detected or are not identified as differentially expressed (DE) in transcriptomic analyses of whole plant organs. Laser Microdissection RNA-Seq (LM RNA-Seq) is a powerful tool to identify genes that are DE in specific developmental domains. However, the choice of cellular domains to microdissect and compare, and the accuracy of the microdissections are crucial to the success of the experiments. Here, two examples illustrate design considerations for transcriptomics experiments; a LM RNA-seq analysis to identify genes that are DE along the maize leaf proximal-distal axis, and a second experiment to identify genes that are DE in liguleless1-R (lg1-R) mutants compared to wild-type. Key elements that contributed to the success of these experiments were detailed histological and in situ hybridization analyses of the region to be analyzed, selection of leaf primordia at equivalent developmental stages, the use of morphological landmarks to select regions for microdissection, and microdissection of precisely measured domains. This paper provides a detailed protocol for the analysis of developmental domains by LM RNA-Seq. The data presented here illustrate how the region selected for microdissection will affect the results obtained.

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

Experimentelles Design für Laser Mikrodissektion RNA-Seq: Lehren aus einer Analyse von Maisblattentwicklung

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

Forschung

Biochemie

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Rapid Collection of Floral Fragrance Volatiles using a Headspace Volatile Collection Technique for GC-MS Thermal Desorption Sampling

Fragrances of many flower families have been sampled and the volatiles analyzed. Knowing the compounds that make up the fragrances can be an important step to conservation of flowers that are threatened or endangered. Because floral fragrance is critical for attracting pollinators, this method could be used to better understand or even enhance pollination. We present a protocol using a portable charcoal air filter and vacuum to collect floral fragrance volatiles, which are then analyzed by a GC-MS. By using this method, fragrance volatiles can be sampled using a non-destructive method with a machine that is easily transported. This methodology uses a rapid sampling procedure, cutting sampling time down from 2-3 hours to approximately 10 minutes. Using GC-MS, the fragrance compounds can be identified individually, based on authentic standards. The steps used for collecting fragrance and control data are presented, from material setup to collecting the data output.

Here, we present a protocol for collecting the floral fragrance volatiles from blooming flowers, using a non-destructive sampling procedure.

Schnelle Sammlung von floralen Duftflüchtigen mit einer Headspace Volatile Collection Technique für GC-MS Thermal Desorption Sampling

Fragrances of many flower families have been sampled and the volatiles analyzed. Knowing the compounds that make up the fragrances can be an important ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

Studium der RNA Interaktoren des RNA während der Säugetier-Zelle Zyklus aktiviert Proteinkinase

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective denaturation of proteins from RNA, 3) ribonuclease inactivation, and 4) removal of contamination from DNA, proteins, and carbohydrates. However, it is very laborious to maintain the integrity of RNA when there are high levels of RNase in the tissue. Spontaneous autolysis makes it very difficult to extract RNA from pancreatic tissue without damaging it. Thus, a practical RNA extraction method is needed to maintain the integrity of pancreatic tissues during the extraction process. An experimental and comparative study of existing protocols was carried out by obtaining 20-30 mg of rat pancreatic tissues in less than 2 minutes and extracting the RNA. The results were assessed by electrophoresis. The experiments were carried out three times for generalization of the results. Immersing pancreatic tissue in RNA stabilization reagent at -80 &#176;C for 24 h yielded high integrity RNA, when the RNA extraction reagent was used as the reagent. The results obtained were comparable to the results obtained from commercial kits with spin column bindings.

The purity and integrity of the isolated RNA is a vital step in RNA dependent assays. Here, we present a practical, rapid, and inexpensive method to extract RNA from a small quantity of undamaged pancreatic tissue.

Schnelle und kostengünstige RNA-Extraktion von Ratten-Pankreasgewebe

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Optische Pinzette untersucht RNA-Protein-Interaktionen in der Translationsregulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ever-increasing share of published structural data. Recent advances in TEM technology and automation have boosted both the speed of data collection and quality of acquired images while simultaneously decreasing the required level of expertise for obtaining cryo-EM maps at sub-3 &#197; resolutions. While most of such high-resolution structures have been obtained using state-of-the-art 300 kV cryo-TEM systems, high-resolution structures can be also obtained with 200 kV cryo-TEM systems, especially when equipped with an energy filter. Additionally, automation of microscope alignments and data collection with real-time image quality assessment reduces system complexity and assures optimal microscope settings, resulting in increased yield of high-quality images and overall throughput of data collection. This protocol demonstrates the implementation of recent technological advances and automation features on a 200 kV cryo-transmission electron microscope and shows how to collect data for the reconstruction of 3D maps that are sufficient for de novo atomic model building. We focus on best practices, critical variables, and common issues that must be considered to enable the routine collection of such high-resolution cryo-EM datasets. Particularly the following essential topics are reviewed in detail: i) automation of microscope alignments, ii) selection of suitable areas for data acquisition, iii) optimal optical parameters for high-quality, high-throughput data collection, iv) energy filter tuning for zero-loss imaging, and v) data management and quality assessment. Application of the best practices and improvement of achievable resolution using an energy filter will be demonstrated on the example of apo-ferritin that was reconstructed to 1.6 &#197;, and Thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstructed to 2.1-&#197; resolution using a 200 kV TEM equipped with an energy filter and a direct electron detector.

High-resolution cryo-EM maps of macromolecules can be also achieved by using 200 kV TEM microscopes. This protocol shows the best practices for setting accurate optics alignments, data acquisition schemes, and selection of imaging areas that are all essential for the successful collection of high-resolution datasets using a 200 kV TEM.